1.2方法
1.2.1 Sprodbtg基因的擴(kuò)增
通過(guò)重疊PCR將SD序列和信號(hào)肽ΔS0949序列克隆于proD-BTG基因的N端，獲得目的基因。第1輪PCR以質(zhì)粒pET28a-prodbtg為模板，以P1、R1為引物擴(kuò)增目的基因；第2輪PCR以第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以P2、R1為引物擴(kuò)增出最終目的基因含SD序列及ΔS0949全長(zhǎng)序列的proD-BTG基因。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min.
1.2.2重組質(zhì)粒pXMJ19-Sprodbtg的構(gòu)建
經(jīng)切膠、回收、純化后的PCR產(chǎn)物（Sprodbtg基因）及pXMJ19質(zhì)粒均用HindⅢ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，分別回收酶切產(chǎn)物，經(jīng)純化后，用T4 DNA連接酶于16,℃連接過(guò)夜并轉(zhuǎn)化至E.coli JM109，然后涂布于含50μg/mL氯霉素的平板，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證。將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為pXMJ19-Sprodbtg.
1.2.3重組菌株C.glutamicum ATCC13032/pXMJ 19-Sprodbtg的構(gòu)建
取6μL構(gòu)建好的質(zhì)粒pXMJ19-Sprodbtg電轉(zhuǎn)化至C.glutamicum ATCC13032感受態(tài)細(xì)胞，電擊條件同挑取轉(zhuǎn)化子酶切驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的重組菌株命名為C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg.質(zhì)粒pXMJ19轉(zhuǎn)化子C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19作為對(duì)照菌株。
1.2.4重組菌C.glutamicumATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg及C.glutamicumATCC13032/pXMJ 19的誘導(dǎo)表達(dá)
分別挑取1環(huán)重組菌C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-Sprodbtg或C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19單菌落，分別接種于裝有50,mL LB培養(yǎng)基的250,mL三角瓶中，30℃、200,r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，以1%,的接種量分別轉(zhuǎn)接于裝有100 mL MMTG的500 mL三角瓶中，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12,h，加入終濃度為1,mmol/L的IPTG誘導(dǎo)酶原蛋白proD-BTG的表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h.分別取1 mL重組菌發(fā)酵液于12,000,r/min離心1,min，獲取上清液，向其中分別加入130μL 100%,TCA，冰上放置30 min，12,000,r/min離心5,min，棄去上清液，加1,mL丙酮洗滌2次。待丙酮揮發(fā)完全后，沉淀分別溶解于20,μL無(wú)菌蒸餾水中，各加入5,μL 5×SDS-PAGE電泳上樣緩沖液，沸水浴5,min，12,000,r/min離心10,min，分別取上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析。
1.2.5酶原蛋白proD-BTG的酶活力測(cè)定
含有酶原蛋白proD-BTG的發(fā)酵液通過(guò)4,000,r/min離心15,min回收上清液，一定量的Factor Xa加入到表達(dá)proD-BTG的重組谷氨酸棒桿菌上清液中切割重組蛋白。隨后通過(guò)熒光定量分析法分析酶原蛋白proD-BTG的酶活力。
酶活力檢測(cè)反應(yīng)體系：90,μL（5,mg/mL）的重組酶和1.98,mL 50,mmol/L Tris-HCl（pH,7.5）包括0.2%,N，N-二甲基酪蛋白，12.5,μmol/L丹磺尸胺（MDC），4.5,mmol/L DTT.反應(yīng)體系于37,℃反應(yīng)30,min，加入42,mmol/L（NH4）2SO4終止反應(yīng)，于激發(fā)波長(zhǎng)350,nm下檢測(cè)發(fā)射波長(zhǎng)500,nm下的熒光強(qiáng)度。
酶活力定義：每分鐘催化1 nmol/L的MDC插入到N，N-二甲基酪蛋白所需的酶量定義為1個(gè)活力單位（U）。
1.2.6重組菌C.glutamicumATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg誘導(dǎo)條件的優(yōu)化
重組菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的繪制：將培養(yǎng)過(guò)夜的菌液按1%,的接種量接入50,mL含有10,μg/mL氯霉素的MMTG培養(yǎng)中，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，間隔一定時(shí)間取樣，以MMTG培養(yǎng)基為空白對(duì)照，檢測(cè)培養(yǎng)液600,nm下的吸光度。以該菌種培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。
最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的確定：分別在接種4、8、12、16、20,h后加入終濃度為1,mmol/L的IPTG開(kāi)始誘導(dǎo)，30,℃誘導(dǎo)48,h，檢測(cè)分析誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)proD-BTG表達(dá)量的影響。
最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定：在最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)加入終濃度為1 mmol/L的IPTG開(kāi)始誘導(dǎo)，30,℃誘導(dǎo)20、30、40、50、60 h，檢測(cè)分析誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)proD-BTG表達(dá)量的變化。
IPTG最佳誘導(dǎo)濃度的確定：在最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)加入終濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2,mmol/L的IPTG開(kāi)始誘導(dǎo)，30,℃誘導(dǎo)至最佳時(shí)間，分析IPTG濃度對(duì)proD-BTG表達(dá)的影響。
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