1.2.4成纖維細(xì)胞生長曲線測定
取傳至第2代、第4代、第6代的龍陵黃山羊成纖維細(xì)胞，胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/孔，接種于24孔培養(yǎng)板。從第2天開始到細(xì)胞長滿，每天隨機(jī)取3孔，連續(xù)7 d記數(shù)。用血球計數(shù)板在倒置相差顯微鏡下計數(shù)，取其平均值，以時間（d）為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。
1.2.5成纖維細(xì)胞的核型檢測
取培養(yǎng)至匯合度為85%左右，并處于對數(shù)生長期的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，參照Sun方法進(jìn)行染色體制備。
1.2.6細(xì)胞活率測定
選取龍陵黃山羊第2、4、6代凍存前后的成纖維細(xì)胞，分別對細(xì)胞進(jìn)行PI染色，在熒光顯微鏡下拍照，統(tǒng)計計算細(xì)胞存活率。
2結(jié)果與分析
2.1龍陵黃山羊成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
耳緣組織塊培養(yǎng)約5 d時，龍陵黃山羊成纖維細(xì)胞、少量類上皮細(xì)胞從組織塊移出生長。隨著培養(yǎng)時間的延長，大量成纖維細(xì)胞從組織塊周圍遷出并迅速增殖，成纖維細(xì)胞呈長梭形。當(dāng)細(xì)胞長至培養(yǎng)皿（瓶）底壁85%左右時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)后，生長速度加快，3～4 d細(xì)胞即可長滿瓶底并再次傳代。原代細(xì)胞及傳代后細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果見圖1。
圖1龍陵黃山羊成纖維細(xì)胞
2.2龍陵黃山羊耳緣成纖維細(xì)胞凍存前及復(fù)蘇后細(xì)胞活率
龍陵黃山羊成纖維細(xì)胞第2代、第4代、第6代凍存前活率分別為93.16%、92.58%、92.01%，復(fù)蘇后活率分別為91.22%、91.06%、90.47%，細(xì)胞在凍存前和復(fù)蘇后都有較高的存活率，均達(dá)90%以上，表明成纖維細(xì)胞培養(yǎng)條件適宜。另外，凍存對成纖維細(xì)胞存活率影響不大。
2.3龍陵黃山羊成纖維細(xì)胞生長的動態(tài)觀察
根據(jù)每組每天測得的結(jié)果，繪制細(xì)胞生長曲線。如圖2所示，各代細(xì)胞都經(jīng)歷了大約72 h的潛伏期，不同代次的細(xì)胞生長曲線均為“S”型。隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞增值速度有所變慢。
圖2龍陵黃山羊成纖維細(xì)胞生長曲線
2.4龍陵黃山羊成纖維細(xì)胞核型分析
參照Levan等的標(biāo)準(zhǔn)，第3代細(xì)胞核型取100個分裂相進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果表明，龍陵黃山羊染色體數(shù)為2n=60的所占比例為91.68%，常染色體及X染色體均為端部著絲粒染色體，說明所培養(yǎng)的細(xì)胞遺傳性能穩(wěn)定，該細(xì)胞系為穩(wěn)定的二倍體細(xì)胞系。
圖3龍陵黃山羊核型圖（母）（1 000×）
3討論
進(jìn)行細(xì)胞染色體核型分析時，當(dāng)山羊的成纖維細(xì)胞用終濃度為0.1μg/mL時，秋水仙素處理時間為7～8 h、低滲時間為18～22min。在配制磷酸鹽緩沖液時，用鈉鹽取代鉀鹽可以得到同樣效果，同時降低了成本。據(jù)吳帥帥等報道，云嶺黑山羊的染色體數(shù)目2n=60；葉紹輝等報道，龍陵黃山羊的染色體數(shù)目為2n=60。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，龍陵黃山羊的染色體數(shù)目為2n=60，與上述結(jié)論一致。
通過繪制龍陵黃山羊第2、4、6代細(xì)胞生長曲線，可以看出隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞增殖速度有所減緩。此外，細(xì)胞解凍后活率也隨著傳代次數(shù)的增加有所降低。而本實(shí)驗(yàn)要求培養(yǎng)的細(xì)胞始終維持二倍體生物學(xué)性狀，保持與體內(nèi)細(xì)胞有較大相似性，因此不能傳代太多，傳6代細(xì)胞不用于實(shí)驗(yàn)就立即低溫凍存。對第3代細(xì)胞中染色體眾數(shù)進(jìn)行檢測，2n=60的占91.68%，染色體沒有異常表現(xiàn)，說明該細(xì)胞系為穩(wěn)定二倍體細(xì)胞系。
本研究建立的龍陵黃山羊耳緣組織成纖維細(xì)胞系增殖快，遺傳性能穩(wěn)定。此細(xì)胞系的建立，不但使龍陵黃山羊這一云南省優(yōu)良遺傳資源在細(xì)胞水平上得以保存下來，而且結(jié)合其他生物技術(shù)，如體細(xì)胞克隆或轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以加快新品種培育速度，從而提高云南省家畜種質(zhì)資源創(chuàng)新利用的技術(shù)水平，并為相關(guān)遺傳學(xué)研究提供了有效的理論依據(jù)和理想的生物材料。同時對于開展其他動物成纖維細(xì)胞系的建立也有一定的理論和技術(shù)指導(dǎo)意義。
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