仿刺參(Apostichopus japonicus)是我國重要的經(jīng)濟海水品種。自2003年開展“北參南養(yǎng)”試驗以來，仿刺參養(yǎng)殖在南方取得蓬勃發(fā)展，福建省已成為我國南方重要的仿刺參養(yǎng)殖產(chǎn)區(qū)，在“北參南養(yǎng)”過程中，疾病問題一直是制約養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的難題。本研究從仿刺參腸道內(nèi)容物中分離獲得一株植物乳桿菌，對菌株生長特性、產(chǎn)酸能力等益生特性進行分析，為水產(chǎn)用益生菌制劑研發(fā)提供備選菌株，為更好地開發(fā)和應用益生菌制劑提供理論支撐。
實驗步驟
細菌濃度和吸光度值的線性相關(guān)曲線
以無菌培養(yǎng)液作為空白對照，取處于對數(shù)生長期的L.plantarum培養(yǎng)液。在波長600 nm分別測定系列稀釋菌懸液的OD值，制作菌濃度與OD值的關(guān)系曲線，獲得線性關(guān)系方程式。
不同條件下培養(yǎng)菌株HY21
MRS液體培養(yǎng)基分別調(diào)節(jié)不同pH和不同NaCl添加量，分別接種2%種子液，在不同溫度條件下進行恒溫培養(yǎng)24 h，測定其OD600值。根據(jù)1.2線性方程式，計算結(jié)果繪制圖表。
菌株的生長曲線及產(chǎn)酸能力的測定
將L.plantarum HY21培養(yǎng)液以2%接種于MRS液體培養(yǎng)基，30°C恒溫厭氧培養(yǎng)。前12 h每1 h取樣一次，后20 h每2 h取樣一次。測定培養(yǎng)液在600 nm處吸光度值并測定培養(yǎng)液pH。
結(jié)果與分析
細菌濃度和吸光度值的線性相關(guān)曲線
L.plantarum HY21的細菌濃度與OD值之間相關(guān)線性關(guān)系的標準曲線如圖1所示。在波長為600 nm下，當吸光度值介于0.054 0–0.848 6之間時，L.plantarum HY21細菌濃度與吸光度值之間線性關(guān)系良好，建立的回歸方程為Y=0.027 34X+0.039 11(R2=0.997 6)。
植物乳桿菌的培養(yǎng)條件和產(chǎn)酸能力
由圖2所示，當pH 4.0–9.0時，植物乳桿菌HY21生長迅速，能大量繁殖。菌株在強酸強堿環(huán)境下生長狀態(tài)明顯受到抑制，對pH 4.0和pH 10.0等環(huán)境具有一定的耐受性。在15°C低溫條件和55°C高溫條件下，生長完全受到抑制，在20–45°C條件下，菌株能夠良好生長。在添加1.0%、1.5%NaCl的MRS培養(yǎng)基中，菌株不受影響能正常生長。當添加NaCl含量大于3.0%時，生長效果逐漸次之。當NaCl添加量達到8.0%時，生長受到抑制，菌體無法增殖。在接種2 h后，迅速進入對數(shù)生長期，9 h后生長速度變緩，14 h時到達最大生長量。0–10 h內(nèi)，菌液pH從5.6快速下降至3.8。18 h后菌液pH變化趨于平緩，基本穩(wěn)定在3.6左右。L.plantarum HY21可以在14 h內(nèi)達到最大生長量和較低的pH。綜上所述，L.plantarum HY21在pH 5.0–8.0的環(huán)境中生長狀態(tài)最佳，耐溫范圍較廣，14 h內(nèi)達到最大生長量和較低的pH。
圖1植物乳桿菌HY21的細菌濃度-吸光度的線性相關(guān)曲線
植物乳桿菌對模擬胃腸液、海鹽溶液、膽汁的耐受性
表1比較了L.plantarum HY21在不同外環(huán)境脅迫下的存活情況。在pH 3.0的人工胃液和pH 6.8的人工腸液中3 h后，L.plantarum HY21存活率分別為118.83%±7.42%和103.85%±3.42%。在不同pH的人工胃腸液中處理不同時間后，所檢測到的L.plantarum HY21活菌數(shù)隨著pH降低而明顯減少；而且經(jīng)pH 2.5處理，隨著時間延長活菌數(shù)顯著減少；但經(jīng)pH 3.0處理，隨時間延長菌數(shù)沒有明顯變化。植物乳桿菌HY21在3%海鹽溶液中處理不同時間后，所檢測到的活菌數(shù)隨時間延長并沒有明顯差異；在處理16 h后存活率仍為97.58%±7.14%。隨著膽汁濃度的增加，植物乳桿菌HY21的活菌數(shù)逐漸減少，存活率逐漸降低；在2.5%、5.0%、10%膽汁環(huán)境下，存活率分別為89.43%±1.27%、87.74%±6.23%、68.11%±7.98%。
圖2不同初始條件下植物乳桿菌HY21的生長量(A?C)和植物乳桿菌HY21的生長與pH變化曲線(D)
表1植物乳桿菌HY21在不同溶液中的存活率(平均值±標準誤，n=3)
討論
不同來源植物乳桿菌的生長特性
對比不同來源植物乳桿菌的生長曲線與產(chǎn)酸曲線發(fā)現(xiàn)，大部分植物乳酸桿菌的生長延滯期較短，大多在2 h后迅速進入對數(shù)期，且產(chǎn)酸較多，大多數(shù)進入穩(wěn)定期時pH小于4.0[14-19]。本試驗菌株HY21的生長曲線和產(chǎn)酸曲線與豬源植物乳酸桿菌GF103[14]的研究結(jié)果相似，2 h后進入對數(shù)期，9 h進入穩(wěn)定期，穩(wěn)定后pH在3.6左右，至20 h進入穩(wěn)定期末期，菌量才出現(xiàn)下降。該結(jié)果表明，菌株HY21有較好的穩(wěn)定性和產(chǎn)酸能力。培養(yǎng)后期可以調(diào)節(jié)pH和添加營養(yǎng)物質(zhì)等方式，在短時間內(nèi)獲得大量發(fā)酵產(chǎn)物和菌體。
表2植物乳桿菌HY21對4株病原菌的抑制作用
圖3植物乳桿菌HY21對4株病原菌的抑制平板
圖4植物乳桿菌HY21清除3種自由基的能力和還原力的比較分析不同小寫字母之間表示差異顯著，相同字母之間表示差異不顯著
溫度是微生物生命活動中重要的環(huán)境因子，當溫度改變時，微生物必須通過調(diào)節(jié)脂類的組成、胞內(nèi)酶的活性、蛋白質(zhì)的合成、基因調(diào)控和RNA的合成以適應環(huán)境溫度的變化。溫度不僅影響乳酸菌的生長，還影響代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量。Fu等[17]從泡菜中分離出植物乳酸桿菌ZJ2868，該菌在20–45°C的溫度范圍內(nèi)均能正常生長，屬于中溫性乳酸菌。菌株HY21在30°C時生長效果最佳，在20–45°C能夠良好生長，與溫度對菌株ZJ2868的生長影響規(guī)律一致，也屬于中溫性乳酸菌。
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