非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起豬的急性烈性傳染病，死亡率可達(dá)100％，非洲豬瘟病毒(ASFV)是一種大的、有囊膜的雙鏈DNA病毒，是最新命名的非洲豬瘟病毒科的唯一成員，也是唯一的蟲媒DNA病毒，病毒基因組全長(zhǎng)為17Okb～190kb，中央有125kb左右的保守區(qū)，兩端為可變區(qū)，含有末端反轉(zhuǎn)重復(fù)序列，這些重復(fù)序列的增加或者缺失是造成不同分離株基因組長(zhǎng)度差異的主要原因[31。非洲豬瘟病毒大多數(shù)毒株的毒力都很強(qiáng)，但是免疫原性很低，只有少數(shù)幾個(gè)蛋白具有免疫原性，現(xiàn)有研究表明，不同區(qū)域ASFV毒株誘導(dǎo)產(chǎn)生的P72抗體的相應(yīng)抗原表位都相當(dāng)保守，P72衣殼蛋白占整個(gè)病毒粒子總蛋白的32％，而且抗原性很穩(wěn)定，常被用來作為血清學(xué)檢測(cè)和免疫制劑，流行病學(xué)研究表明，由于ASFV的高致死性和高度傳染性，目前又無有效的疫苗，所以對(duì)待ASFV的方針歷來是嚴(yán)密的檢查和大批屠殺，所以建立一套高效安全的診斷方法是必不可少的，目前的研究是利用基因重組技術(shù)，將非洲豬瘟病毒P72基因(1938bp)克隆到質(zhì)粒載體中，在大腸桿菌中表達(dá)衣殼蛋白P72，利用pET-30c(+)載體所具有的6組氨酸序列，通過鎳柱進(jìn)一步純化融合的目的蛋白，為建立以重組蛋白為檢測(cè)抗原的非洲豬瘟診斷方法奠定基礎(chǔ)。
大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)常用于疫苗研究工作，有利于研制針對(duì)非洲豬瘟的高效疫苗。然而，目前的大腸桿菌重組菌在重組培育過程中，其營(yíng)養(yǎng)液成分比較單一，主要依靠瓊脂為大腸桿菌重組菌提供營(yíng)養(yǎng)成分，而非洲豬瘟疫苗研究工作需要較多的參照載體，需針對(duì)大腸桿菌重組菌進(jìn)行大量繁殖，而在大腸桿菌重組菌后續(xù)大量繁殖時(shí)，單一的營(yíng)養(yǎng)液成分無法滿足其需求，進(jìn)而造成局部大腸桿菌重組菌營(yíng)養(yǎng)含量不足，發(fā)生死亡和停止生長(zhǎng)繁育的問題，最終對(duì)實(shí)驗(yàn)成品的品質(zhì)會(huì)造成影響，導(dǎo)致后續(xù)一系列的實(shí)驗(yàn)均受到影響，不利于非洲豬瘟疫苗的研制工作。
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，下面提供了一種表面表達(dá)非洲豬瘟IrrE蛋白的大腸桿菌重組菌的培育方法，解決了大腸桿菌重組菌在重組培育過程中，其營(yíng)養(yǎng)液成分比較單一、造成局部大腸桿菌重組菌營(yíng)養(yǎng)含量不足，發(fā)生死亡和停止生長(zhǎng)的問題，以此提升實(shí)驗(yàn)成品的品質(zhì)，有利于后續(xù)非洲豬瘟疫苗的研制工作。
具體步驟如下：
S1、材料準(zhǔn)備：IrrE重組大腸桿菌材料，限制性內(nèi)切酶；T4連接酶，卡那霉素，蛋白電泳主要溶液、蛋白上樣緩沖液以及培養(yǎng)基；
S2、培養(yǎng)基配制：采用LB培養(yǎng)基，LB液體培養(yǎng)基內(nèi)部配置有精解蛋白胨1.0％，酵母浸出粉0.5％，氯化鈉1.0％，接著并攪拌使之完全溶解，用5molNaOH(about0.2ml/1000ml培養(yǎng)基)調(diào)pH至7.0，高壓滅菌20min(120℃0.1Mpa)；
S3、細(xì)菌培養(yǎng)：首先將IrrE重組大腸桿菌活化，將保存于-80℃的IrrE重組大腸桿菌甘油菌室溫解凍，取500ul菌接入50mlLB培養(yǎng)基內(nèi)，再加入相對(duì)應(yīng)的篩選抗性，37℃培養(yǎng)7h；然后上罐，將上步活化的IrrE重組大腸桿菌50ml接入3L發(fā)酵培養(yǎng)基中，設(shè)定溫度，空氣流量，壓力值，監(jiān)控DO與PH值；
S4、營(yíng)養(yǎng)液準(zhǔn)備：一等份的蛋白胨、一等份的乳糖、一等份的磷酸氫二鉀、一等份的維生素和一等份的氨基酸以及一等份的葡萄糖與果糖與一等分微量元素(包括鐵、銅、錳、鋅、鈷、鉬、鉻、鎳、釩、氟、硒、碘、硅、錫)，最后加入五等份的純凈無菌水，接著采用殺菌后的攪拌棒對(duì)各項(xiàng)營(yíng)養(yǎng)材料進(jìn)行充分?jǐn)嚢枧c混合，直至其形成粘稠狀物質(zhì)，此時(shí)根據(jù)肉眼觀察IrrE重組大腸桿菌的生長(zhǎng)情況，逐次添加總材料的三分之一，共添加三次，直至材料全部添加結(jié)束；
備注：維生素的種類包括包括維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12，氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天門冬酰胺。
S5、檢測(cè)與后期儲(chǔ)存：當(dāng)肉眼觀察IrrE重組大腸桿菌基本布滿培養(yǎng)基的內(nèi)部底端面時(shí)，可以停止添加新的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)從發(fā)酵4小時(shí)開始，每隔1h進(jìn)行取樣檢測(cè)OD，當(dāng)OD值≥40時(shí)，開始誘導(dǎo)；誘導(dǎo)物：IPTG(1mol/L，過濾除菌)，加入4ml，至終濃度達(dá)到1mmol/L，誘導(dǎo)階段溫度控制再35℃，其他條件不變，誘導(dǎo)10小時(shí)；誘導(dǎo)結(jié)束后，放罐，5000rpm離心，收集菌體，于-80℃冰箱保存；
備注：不同濃度的IPTG均能夠誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，當(dāng)IPTG濃度達(dá)到2mmol/L，37℃培養(yǎng)6h時(shí)，目的蛋白的可溶性表達(dá)最為明顯，因此，可以將IrrE蛋白的最佳誘導(dǎo)條件設(shè)置為IPTG終濃度2mmol/L、誘導(dǎo)溫度37℃、誘導(dǎo)時(shí)間6h。
S6、數(shù)據(jù)記錄：挑取IrrE重組大腸桿菌接種于50mL含有卡那霉素(50μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，設(shè)定37℃、180r/min進(jìn)行振蕩過夜培養(yǎng)，然后以0.5％接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的含有2mmol/LIPTG、50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基之中，37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)，每間隔2h取樣測(cè)定A600，繪制生長(zhǎng)曲線。
綜上所述，該表面表達(dá)非洲豬瘟IrrE蛋白的大腸桿菌重組菌的培育方法，通過在對(duì)IrrE重組大腸桿菌生長(zhǎng)中，持續(xù)添加新的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，確保IrrE重組大腸桿菌的正常、快速的生長(zhǎng)繁殖，改進(jìn)了現(xiàn)有技術(shù)主要依靠瓊脂為大腸桿菌重組菌提供營(yíng)養(yǎng)成分的局限性，解決了目前大腸桿菌重組菌在重組培育過程中，其營(yíng)養(yǎng)液成分比較單一、在大腸桿菌重組菌后續(xù)大量繁殖時(shí)，無法滿足其需求，進(jìn)而造成局部大腸桿菌重組菌營(yíng)養(yǎng)含量不足，發(fā)生死亡和停止生長(zhǎng)繁育的問題，以此提升實(shí)驗(yàn)成品的品質(zhì)，有利于后續(xù)非洲豬瘟疫苗的研制工作。
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