鴨腸炎病毒(duck enteritis virus,DEV)屬于皰疹病毒，能感染鴨、鵝等雁形目禽類，可引起產(chǎn)蛋下降及高死亡率，已報道了多株DEV的全基因組序列，DEV基因組大，長度約158—162 kb。與疫苗株相比，DEV疫苗檢驗用參考強(qiáng)毒株基因組UL區(qū)5′端連續(xù)插入3 513 bp（2 716—6 228位核苷酸）導(dǎo)致UL56基因移框突變。目前關(guān)于DEV基因功能、致病機(jī)理等報道較少。本研究通過構(gòu)建了重組病毒，以研究連續(xù)3 513 bp插入對DEV生物特性的影響；以提取的DEV基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增UL56基因上下游兩端同源臂UL56-u、UL56-d。將兩同源臂片段克隆到pMD18T-Simple載體，獲得重組質(zhì)粒pT-UL56ud。將重組質(zhì)粒pT-UL56ud用I酶切，電泳回收去磷酸化后，將紅色熒光蛋白（RFP）表達(dá)盒插入到pT-UL56ud中，獲得重組質(zhì)粒pT-UL56-RFP。
DEV接種鴨胚成纖維細(xì)胞（DEF）（MOI=0.1），吸附1—2 h后，按Lipofectamine 2000說明書轉(zhuǎn)染高純質(zhì)粒pT-UL56-RFP，通過同源重組的方法，以紅色熒光蛋白（RFP）基因為報告基因，構(gòu)建了缺失DEV UL56下游3 513 bp的重組病毒DEV△3513及其回復(fù)株DEVΔ3513(R)。將重組病毒及其親本病毒分別接種25 cm2的細(xì)胞瓶中（MOI=0.01），測量其病毒含量，繪制一步生長曲線；將重組病毒及其親本病毒分別作適當(dāng)稀釋，接種已長成單層DEF，加入M199營養(yǎng)瓊脂糖覆蓋，培養(yǎng)5—7 d，隨機(jī)選取20個蝕斑，測量蝕斑面積；將重組病毒、回復(fù)株及其親本病毒分別以105.0TCID50肌肉注射6周齡易感麻鴨進(jìn)行致病性試驗，觀察10 d，每天記錄發(fā)病死亡情況。試驗結(jié)束后剖檢所有存活鴨。對全部動物取肝臟組織，固定于4%多聚甲醛溶液，按常規(guī)程序制備病理切片并進(jìn)行H.E染色；將重組病毒及鴨瘟商品化活疫苗株（CVCC AV1222）分別以103.0TCID50肌肉注射6周齡易感麻鴨進(jìn)行免疫原性試驗，在免疫后14 d，腿部肌肉注射接種DEV強(qiáng)毒（CVCC AV1221），每只103.0MLD。
觀察10 d，每天記錄發(fā)病死亡情況。通過同源重組的方法，獲得攜帶RFP的重組病毒DEV△3513-RFP、缺失DEV UL56下游3 513 bp的重組病毒DEV△3513及其回復(fù)株DEVΔ3513(R)。重組病毒DEVΔ3513、DEVΔ3513(R)及其親本毒均在接種DEF后72 h，病毒含量達(dá)到峰值（106.2-6.5TCID50/0.1 mL），病毒含量無明顯差異；均能在DEF細(xì)胞中形成清晰蝕斑，大小無明顯差異；DEVΔ3513對6周齡易感麻鴨毒力明顯減弱，未出現(xiàn)任何臨床癥狀和死亡；DEVΔ3513以103.0TCID50/只免疫麻鴨，能抵抗DEV強(qiáng)毒株的攻擊；成功構(gòu)建了缺失UL56基因下游3 513 bp的重組病毒，首次證實UL56基因下游3 513 bp對DEV在細(xì)胞中的復(fù)制是非必需的；缺失UL56基因下游3 513 bp后病毒仍保留良好的免疫原性；UL56基因下游3 513 bp是DEV的一個毒力決定因子。
【研究意義】鴨腸炎病毒（duck enteritis virus,DEV），又稱鴨瘟病毒，屬于皰疹病毒科，能引起鴨、鵝等雁形目禽類發(fā)生急性、熱性、敗血性的傳染病。該病也稱為鴨瘟，發(fā)病率和死亡率很高，對水禽養(yǎng)殖業(yè)危害很大。
本研究根據(jù)DEV強(qiáng)弱株基因組差異，擬分析DEV毒力相關(guān)基因，解析DEV致病機(jī)制，探索外源基因插入位點、活載體疫苗開發(fā)的可行性。
【前人研究進(jìn)展】目前已完成多株DEV全基因組測序。DEV疫苗檢驗用參考強(qiáng)毒株（CVCC AV1221）于1962年從南京一鴨場分離，是我國較早分離的一個強(qiáng)毒，毒力穩(wěn)定，是我國官方評價鴨瘟疫苗免疫效果的參考強(qiáng)毒，其基因組全長為162 131 bp。與參考強(qiáng)毒株基因組相比，DEV疫苗株UL區(qū)5′端連續(xù)缺失了3 513 bp（2 716—6 228位核苷酸）導(dǎo)致UL56基因移框突變；德國分離DEV 2085株基因組在2 561位核苷酸后連續(xù)缺失1 170 bp，該區(qū)域是否與DEV毒力相關(guān)，尚未見報道。
【本研究切入點】本研究以紅色熒光蛋白（RFP）為報告基因，構(gòu)建缺失UL56基因下游3 513 bp的重組病毒，比較缺失前后病毒在細(xì)胞中的生長特性以及對易感鴨的致病性、免疫原性。
【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究旨在分析UL56基因下游3 513 bp對DEV生物特性的影響，為揭示DEV UL56基因下游3 513 bp功能、DEV活載體疫苗研究奠定基礎(chǔ)。
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