1.5試驗(yàn)方法
1.5.1菌株的活化與分離
將實(shí)驗(yàn)室-80℃超低溫冰箱中保存的36株乳酸菌在MRS固體平板上劃線，然后將平板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。從平板上挑取單菌落進(jìn)行二次平板劃線分離，37℃培養(yǎng)24 h，再次從平板上挑取單菌落。
1.5.2菌株發(fā)酵
將挑取的36株乳酸菌的單菌落分別接種于10 mL MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16 h。然后按1%的接種量轉(zhuǎn)接于30 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h后，測(cè)定樣品中磷酸吡哆醛的含量。
1.5.3磷酸吡哆醛標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
將磷酸吡哆醛在超純水中溶解，配制成濃度分別為0.25，0.3，0.5，1.0，1.5，2.0 g/L和2.5 g/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后通過(guò)島津LC-2010A高效液相色譜儀測(cè)定不同含量的磷酸吡哆醛溶液產(chǎn)生的峰面積。以磷酸吡哆醛的含量(g/L)為橫坐標(biāo)，峰面積(mV·min)為縱坐標(biāo)，繪制磷酸吡哆醛的標(biāo)準(zhǔn)曲線。高效液相色譜的條件為：色譜柱，安捷倫Eclipse plus C18(4.6 mm x 250 mm，5μm)；流動(dòng)相，磷酸二氫鉀緩沖液(pH=6.0):乙腈=70:30；流速，1.0 mL/min；柱溫，30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)，388 nm；進(jìn)樣體積，10μL。
1.5.4發(fā)酵液中磷酸吡哆醛含量的檢測(cè)
將發(fā)酵液移至10 mL無(wú)菌離心管中，4℃，7000 r/min離心15 min。用2.5 mL的注射器將上清液經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后注入液相瓶，用高效液相色譜儀檢測(cè)上清液中磷酸吡哆醛的含量。
1.6乳酸菌的益生特性
1.6.1菌株生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸特性
將100μL的乳酸菌菌液接種于10 mL新配制的MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)。每隔2 h取樣，測(cè)定樣品的pH值。然后將樣品稀釋10倍，測(cè)定其在600 nm處的光密度值，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線與產(chǎn)酸特性曲線。
1.6.2菌株最適生長(zhǎng)溫度
按照1.0%的接種量將菌液接種于10 mL新配制的MRS培養(yǎng)基中，分別置于25，30，37，42℃和60℃下靜置培養(yǎng)18 h測(cè)定菌液在600 nm處的光密度值，確定菌株的最合適生長(zhǎng)溫度。
1.6.3菌株最適pH值
按照1.0%的接種量將菌液分別接種于10 mL新配制的初始pH值分別為4.0，5.0，6.0，7.0和8.0的MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)18 h后，測(cè)定其在600 nm處的光密度值，確定菌株的最合適生長(zhǎng)pH值。
1.6.4菌株耐過(guò)氧化氫能力
在液體MRS培養(yǎng)基中添加過(guò)氧化氫，使其終濃度分別為0.25，0.5，0.75 mmol/L和1.0 mmol/L。將100μL乳酸菌菌液接種于上述培養(yǎng)集中，37℃靜置培養(yǎng)8 h后，測(cè)定其在600 nm處的光密度值，確定菌株對(duì)過(guò)氧化氫的耐受能力。
1.6.5菌株的耐鹽能力
在液體MRS培養(yǎng)基中添加氯化鈉，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2%，4%，6%，8%和10%。將100μL乳酸菌菌液接種于上述培養(yǎng)集中，37℃靜置培養(yǎng)8 h后，測(cè)定其在600 nm處的光密度值，確定菌株對(duì)氯化鈉的耐受能力。
1.6.6菌株的低溫耐受能力
取500μL菌液接種至50 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)。當(dāng)菌液在600 nm的光密度值達(dá)到1.0時(shí)，將其分裝至10 mL無(wú)菌離心管中，于-20℃冰箱中冷處理1，3，5，7 d和10 d，分別測(cè)定不同冷處理?xiàng)l件下菌株的活菌數(shù)。
1.6.7菌株的自凝集能力
將已活化2次的菌液離心，去上清。用磷酸緩沖液(PBS，pH 7.0)洗滌并重懸菌體，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0x10^8 CFU/mL，于37℃靜置培養(yǎng)。測(cè)定上層細(xì)胞懸液在不同時(shí)間的光密度值。按照下列公式計(jì)算菌株的自凝集率。當(dāng)時(shí)間是x h時(shí)的OD600 nm記為A_x，初始OD600 nm記為A_0。自凝集率(%)=(1-A_x/A_0)x100。
1.6.8菌株耐酸能力
首先接種200μL的菌液于10 mL初始pH值為7.0的MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)。當(dāng)菌體在600 nm處的光密度值為1.0時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至10 mL的無(wú)菌離心管中，于4℃，7000 r/min離心15 min。棄上清液。沉淀的菌體經(jīng)磷酸緩沖液洗滌2次后，將菌體轉(zhuǎn)移至初始pH值分別為2.0，3.0和3.5的MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)0.5，1，2 h和3 h時(shí)搖勻取樣，測(cè)定其活菌數(shù)，繪制菌株的耐酸曲線。
1.6.9菌株的耐膽鹽能力
接種200μL乳酸菌菌液于10 mL MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)至OD600 nm為1.0。離心去上清液，沉淀的菌體用磷酸緩沖液洗滌2次。將菌體轉(zhuǎn)移至含膽鹽濃度分別為0.03%，0.1%和0.3%的MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)0.5，1，2 h和3 h時(shí)搖勻取樣，測(cè)定其活菌數(shù)，繪制菌株的耐膽鹽曲線。
1.6.10菌株的抑菌能力
接種200μL菌液至10 mL MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h，然后將菌液分裝到1.5 mL無(wú)菌離心管中，4℃，12000 r/min離心10 min。上清液經(jīng)0.22μm有機(jī)膜過(guò)濾。將100μL熒光假單胞菌、大腸桿菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌分別接種于10 mL LB培養(yǎng)基中，于37℃，180 r/min的條件下培養(yǎng)12 h。取1%的指示菌菌液轉(zhuǎn)接于50 mL LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600 nm為0.5時(shí)，置于冰上備用。將滅菌的MRS固體培養(yǎng)基倒平板，冷卻凝固。將半固體LB培養(yǎng)基與2%的備用指示菌菌液混合，輕輕晃勻，倒入已凝固的MRS平板上，待其稍微凝固后立即將滅菌的牛津杯置于固體平板上。在牛津杯中加入200μL經(jīng)有機(jī)膜過(guò)濾的發(fā)酵上清液。將雙層平板放在常溫下冷卻40 min后，分別于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈的直徑。
1.7數(shù)據(jù)處理
試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0軟件，數(shù)據(jù)繪圖采用Origin 8.5軟件。
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