腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)是一種革蘭氏陰性運(yùn)動(dòng)桿菌，具有較強(qiáng)的致腐敗能力，是水產(chǎn)品的特定腐敗菌之一，其生長(zhǎng)代謝活動(dòng)中能夠分解肌肉蛋白，將氨基酸脫羧生成腐胺、尸胺等生物胺，產(chǎn)生H2S等臭味物質(zhì)，其形成的生物被膜可導(dǎo)致水產(chǎn)品表面發(fā)黏。微生物的生長(zhǎng)和繁殖是引起水產(chǎn)品腐敗的主要因素。
酚酸是高等植物中分布廣泛的一類含有酚羥基和羧基的重要次生代謝產(chǎn)物，有調(diào)查顯示，人體內(nèi)每日攝入的酚酸是所攝入總酚含量的1/3，攝入含量為25～1 000 mg，目前許多保健品中均含有綠原酸及咖啡酸等成分，可以有效地促進(jìn)血液循環(huán)、淡化黃褐斑、緩解腰酸腿痛等癥狀。將酚酸作為功能性食品添加劑，添加到各類啤酒和葡萄酒當(dāng)中，能起到保肝護(hù)脾的作用。常見酚酸如沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸等，已被應(yīng)用于食品加工和保鮮等領(lǐng)域。沒食子酸作為一種較為常見的酚酸，對(duì)各種食源性致病菌如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和弗氏志賀菌均具有較強(qiáng)的抗菌作用。沒食子酸在體外具有抗假單胞菌的效果。然而，目前尚未見沒食子酸、原兒茶酸和綠原酸對(duì)水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌的抑制作用的研究報(bào)道。研究擬比較沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸3種酚酸對(duì)腐敗希瓦氏菌的抑制活性，并通過全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)分析儀、流式細(xì)胞儀、細(xì)胞膜完整性和通透性測(cè)定研究沒食子酸對(duì)腐敗希瓦氏菌的抑菌作用及機(jī)制，以期為酚酸在水產(chǎn)品保鮮中的應(yīng)用提供參考。
1材料與方法
1.1材料與儀器
1.1.1材料與試劑
腐敗希瓦氏菌SP22(ShewanellaputrefaciensSP22)：渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室從腐敗大菱鲆中分離獲得并在-80℃下保藏；
LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB營(yíng)養(yǎng)肉湯：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；
沒食子酸、綠原酸、原兒茶酸：上海源葉生物科技有限公司；
蛋白濃度測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所；
碘化丙啶(PI)、戊二醛、PBS溶液：北京索萊寶科技有限公司。
1.1.2儀器設(shè)備
立式高壓蒸汽滅菌鍋：mLS-3030CH型，日本三洋有限公司；
全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)分析儀：芬蘭Bioscreen公司；
超速離心機(jī)：cs 150 gx3型，日本日立公司；
酶標(biāo)儀：Victor X3型，新加坡珀金埃爾默儀器有限公司；
紫外可見分光光度計(jì)：UV2550型，尤尼柯儀器有限公司；
電子分析天平：MS105UD型，瑞士Mettler Toledo公司；
掃描電鏡：S-4800型，美國(guó)BIO-RAD公司；
電導(dǎo)率儀：FE38-Meter型，瑞士Mettler Toledo公司；
流式細(xì)胞儀：Accuri C6 Plus型，美國(guó)BD公司。
1.2方法
1.2.1菌懸液制備將貯藏于-80℃的腐敗希瓦氏菌取出，接種于LB肉湯培養(yǎng)基中在28℃，110 r/min搖床震蕩培養(yǎng)活化2代，并稀釋菌液濃度為105CFU/mL，備用。
1.2.2不同酚酸的抑菌直徑測(cè)定分別配制濃度為7.5，5.0，2.5 mg/mL沒食子酸(GA)、綠原酸(CA)和原兒茶酸(PA)水溶液。將2 mL菌懸液(105CFU/mL)加入到200 mL無菌LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中混勻，向垂直放置3個(gè)牛津杯的培養(yǎng)皿中傾注約20 mL，放置至LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂徹底凝固。取出牛津杯，分別向孔中加入不同酚酸溶液200μL，每個(gè)濃度做3個(gè)平行組。將平板倒置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑大小。
1.2.3最小抑菌濃度(MIC)及最小殺菌濃度(MBC)測(cè)定采用微量肉湯二倍稀釋法進(jìn)行抑菌劑MIC和MBC測(cè)定。采用LB液體培養(yǎng)基在96孔板中進(jìn)行酚酸溶液的二倍梯度稀釋，分別獲得最終濃度為5.000 0，2.500 0，1.250 0，0.625 0，0.372 50，0.156 25 mg/mL的3種酚酸系列溶液。每孔接種100μL腐敗希瓦氏菌菌懸液(105CFU/mL)，混勻后放入28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。以肉眼觀察，沒有變渾濁的最低濃度為酚酸對(duì)該菌的MIC，每組重復(fù)3次。將無菌生長(zhǎng)的孔中的液體吸出涂布于LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h，無菌生長(zhǎng)的濃度為酚酸的MBC。
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