上呼吸道感染（upper respiratory tract disease，URTD）是貓常見的臨床疾病，是引起幼貓死亡的重要原因之一，通常由一種或多種病原感染引起，從而出現(xiàn)以呼吸道或眼部疾病為特征的貓呼吸道疾病癥候群。引起URTD的病原很多，但主要為貓杯狀病毒（feline calicivirus，F(xiàn)CV）、貓皰疹病毒1型（feline herpesvirus type 1，F(xiàn)HV-1）和貓流感病毒（feline influenza virus，F(xiàn)IV）。
FCV在貓群中的感染率很高，常引起貓口腔潰瘍和上呼吸道癥狀，也可引起其他疾病，如跛行、流產(chǎn)、慢性胃腸炎、尿道感染等。該病毒既可單獨(dú)感染，也可與其他病原混合感染，嚴(yán)重危害貓及貓科動(dòng)物的健康。FHV-1是一種高度接觸性傳染病原，也可垂直傳播，引起的發(fā)病率很高，可達(dá)100%，但成年貓感染后病死率很低，幼貓感染后癥狀嚴(yán)重，病死率可達(dá)50%，未死亡的貓可終生帶毒排毒，危害很大。貓及貓科動(dòng)物都對(duì)FIV十分易感，通過食入感染的動(dòng)物性食品或接觸感染的人和動(dòng)物都很容易被感染。目前在貓及貓科動(dòng)物身上已分離到多種亞型FIV，包括H1N1、H5N1、H5N6及H7N2等。秋冬為貓呼吸道疾病高發(fā)季節(jié)，為此本研究對(duì)患有上呼吸道癥狀疾病的臨床貓病例進(jìn)行FCV、FHV-1和FIV的分離與鑒定，了解在該季節(jié)上海市貓上呼吸道疾病病例中FCV、FHV-1和FIV的感染比例，為貓上呼吸道疾病的防控和治療提供依據(jù)。
1材料和方法
1.1樣品及來源
2020年11月至2021年3月，以上海市中心城區(qū)寵物醫(yī)院接診的以及來自貓舍的具有上呼吸道感染癥狀的貓為研究對(duì)象，采集每只患病貓的眼結(jié)膜、口咽和鼻黏膜拭子53份，其中寵物醫(yī)院30份、貓舍23份，每個(gè)病例樣品一式兩份。樣品采集好后立即送至上海獸醫(yī)疾病診斷中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒分離與鑒定。
1.2主要試劑
F81細(xì)胞（貓腎傳代細(xì)胞），由上海獸醫(yī)疾病診斷中心實(shí)驗(yàn)室保存；SPF雞胚（批號(hào)11401000020754），購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液（批號(hào)2126865）、0.25%的胰酶消化液（批號(hào)2042303），均購(gòu)自GIBCO公司；胎牛血清（批號(hào)2418），購(gòu)自SIGMA公司；核酸提取試劑盒（批號(hào)MDII14-01），購(gòu)自Magen公司；PrimeScriptTMRT-PCR Kit（批號(hào)AJ62323A）、LA PCR?Kit Ver.2.1（批號(hào)AK5301）、Prime Script?One Step RT-PCR Kit Ver.2（Dye Plus）（批號(hào)AKE0559A），均購(gòu)自寶生物工程（大連）公司。
1.3病原分離、鑒定及同源性分析
1.3.1 FCV F81細(xì)胞常規(guī)消化傳代，待長(zhǎng)成單層且貼壁率達(dá)到90%時(shí)，將細(xì)胞按照1:3的比例消化傳代，同時(shí)將待測(cè)樣品經(jīng)過0.22μm濾膜過濾后同步接種到細(xì)胞中，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每12 h觀察細(xì)胞病變（CPE）1次；待70%細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)，將培養(yǎng)液凍融3次，2 000 r/min離心5 min，收獲細(xì)胞上清；96 h后將未出現(xiàn)CPE的細(xì)胞上清收獲，盲傳3代，收獲第3代細(xì)胞上清提取病毒RNA。根據(jù)文獻(xiàn)合成FCVVP1基因檢測(cè)引物（上游：ATGTGCTCAACCTGCGC；下游：TCATAATTTAGTCATTGAGCTCCT），擴(kuò)增片段大小為2 007～2 010 bp。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。按照PrimeScriptTMRT-PCR Kit說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增后取5μL RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽(yáng)性RT-PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用MEGA 6.0軟件和DNAstar v7.1軟件，對(duì)FCVVP1基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，比較其與GenBank中參考序列核苷酸同源性差異，繪制基因進(jìn)化樹。
1.3.2 FHV-1按照1.3.1中的病毒分離步驟進(jìn)行病毒分離，將收獲的第3代細(xì)胞上清提取病毒DNA。根據(jù)FHV-1gB基因保守序列（S49775.1）合成基因檢測(cè)引物（上游：GGGGTGGGTGGACGGTGAGTAA；下游：TAGGTCTCCAGGGTTCCAGTCT）。擴(kuò)增片段大小為1 798 bp。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。按照PrimeScriptTMRT-PCR Kit說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增后取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用MEGA 6.0軟件和DNAstar v7.1軟件，對(duì)FHV-1gB基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，比較其與GenBank中參考序列核苷酸同源性差異。
1.3.3 FIV將另外一份待檢樣品經(jīng)0.22μm濾膜過濾后尿囊腔接種到10日齡SPF雞胚中，37℃孵化箱中培養(yǎng)，每24 h照胚1次，并將死亡雞胚及時(shí)保存至4℃冰箱，96 h后將所有雞胚放至4℃冰箱過夜，收獲雞胚尿囊液，測(cè)定其血凝性；如有血凝性則作進(jìn)一步鑒定，沒有血凝性則進(jìn)行盲傳，收獲第3代雞胚尿囊液作進(jìn)一步鑒定；對(duì)雞胚尿囊液進(jìn)行HA試驗(yàn)，根據(jù)文獻(xiàn)合成引物對(duì)HA和NA編碼序列進(jìn)行測(cè)定（HA上游：GGGGAATTTCACAACCACTCAAG；HA下游：TTGAGTAGAAACAAGGGTGTTTC。NA上游：AGCAAAAGCAGGAGTRAAAATGA；NA下游：GGCAAGTAGAAACAAGGAGTT）。擴(kuò)增片段HA為1 742 bp，NA為1 457 bp。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。PCR擴(kuò)增后經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)。
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