2.5沒(méi)食子酸對(duì)溶藻弧菌生物被膜的清除作用
不同濃度沒(méi)食子酸對(duì)溶藻弧菌成熟生物被膜清除的影響如圖5所示。與對(duì)照組相比，1/2MIC、1MIC和2MIC的沒(méi)食子酸溶液能顯著清除成熟的溶藻弧菌生物被膜(P<0.05)，清除率分別為54.5%、67.54%和68.01%。結(jié)果表明，1/2MIC以上濃度的沒(méi)食子酸對(duì)溶藻弧菌成熟的生物被膜清除作用明顯，且清除作用隨其濃度的增加而增強(qiáng)。
2.6沒(méi)食子酸對(duì)溶藻弧菌泳動(dòng)能力的影響
a：1/2MIC；b：1/4MIC；c：未添加。
a:1/2MIC;b:1/4MIC;c:No addition.
沒(méi)食子酸對(duì)溶藻弧菌泳動(dòng)的影響如圖6、7所示。1/2MIC和1/4MIC濃度的沒(méi)食子酸對(duì)溶藻弧菌泳動(dòng)能力有顯著的抑制作用(P<0.05)，較對(duì)照組分別減少60.41%(P<0.05)和51.78%(P<0.05)，2MIC和1MIC濃度的沒(méi)食子酸能完全抑制溶藻弧菌的生長(zhǎng)，平板上未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。結(jié)果表明，1/4MIC以上濃度的沒(méi)食子酸能顯著抑制溶藻弧菌的泳動(dòng)能力，且抑制作用隨濃度的增加而增強(qiáng)。
2.7沒(méi)食子酸對(duì)溶藻弧菌聚集能力的影響
不同濃度沒(méi)食子酸對(duì)溶藻弧菌聚集能力的影響如圖8所示。陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)菌間的聚集能力為44.08%，1/4MIC、1/2MIC、1MIC和2MIC濃度的沒(méi)食子酸能顯著降低溶藻弧菌的聚集能力，聚集能力分別被降至37.41%、25.70%、19.19%和18.68%，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。
討論
隨著生活水平的提高，人們對(duì)于食品安全的關(guān)注度越來(lái)越高，2021年1月農(nóng)業(yè)農(nóng)村部印發(fā)了《關(guān)于加強(qiáng)水產(chǎn)養(yǎng)殖用投入品監(jiān)管的通知》，其中指出開(kāi)展水產(chǎn)養(yǎng)殖用獸藥、飼料和飼料添加劑相關(guān)違法行為三年專項(xiàng)整治，在全國(guó)試行水產(chǎn)養(yǎng)殖用投入品使用白名單制度。但目前合規(guī)的水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治藥物較少，加之養(yǎng)殖模式和病原區(qū)系特征的不斷變化，尋找綠色高效的防治藥物成為當(dāng)前水產(chǎn)病害防治的研究熱點(diǎn)之一。
沒(méi)食子酸作為一種多酚類化合物，廣泛存在于植物中，也可通過(guò)生物或化學(xué)合成方式大量獲得，具有較好的抗菌活性。研究證實(shí)，沒(méi)食子酸對(duì)遲緩愛(ài)德華菌(Edwardsiella tarda)、柱狀黃桿菌(Flavobacterium columnare)、溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)和豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)等４種水產(chǎn)動(dòng)物致病菌的抑菌圈直徑可達(dá)25~30 mm。研究結(jié)果顯示，沒(méi)食子酸對(duì)副溶血弧菌的MIC為3 mg/mL。本研究結(jié)果顯示，沒(méi)食子酸對(duì)溶藻弧菌的MIC和MBC分別為4 mg/mL和8 mg/mL，MBC/MIC為2，說(shuō)明沒(méi)食子酸對(duì)溶藻弧菌具有良好的殺菌作用；生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果表明，4 mg/mL以上濃度的沒(méi)食子酸能完全抑制溶藻弧菌生長(zhǎng)，2 mg/mL的沒(méi)食子酸明顯抑制溶藻弧菌的快速生長(zhǎng)，生長(zhǎng)平臺(tái)期菌液濃度明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組，提高沒(méi)食子酸藥物濃度可縮短藥物的抑菌作用時(shí)間，說(shuō)明沒(méi)食子酸對(duì)溶藻弧菌的抑制效果呈劑量依賴性，因此，選用沒(méi)食子酸抑制溶藻弧菌生長(zhǎng)時(shí)，應(yīng)選用4 mg/mL及以上濃度方能達(dá)到良好的抑菌作用。
當(dāng)細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜遭到破壞時(shí)，細(xì)胞膜通透性增高，細(xì)胞內(nèi)容物流出，細(xì)菌胞外的AKP活性和電導(dǎo)率會(huì)顯著升高。研究發(fā)現(xiàn)，沒(méi)食子酸能使高敏感菌單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)出現(xiàn)凹陷、破損、細(xì)胞原生質(zhì)泄漏。地榆提取物能破壞多重耐藥大腸埃希氏菌(multidrug-resistant Escherichia coli)的細(xì)胞壁，顯著提高胞外的AKP含量。本研究中1、2、4、8 mg/mL濃度的沒(méi)食子酸能在2 h內(nèi)破壞溶藻弧菌的細(xì)胞壁，導(dǎo)致AKP漏出；沒(méi)食子酸能使溶藻弧菌培養(yǎng)物的電導(dǎo)率增加，說(shuō)明沒(méi)食子酸也可破壞溶藻弧菌細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致通透性增加，且破壞程度呈劑量依賴性。
生物被膜是由細(xì)菌分泌的胞外多聚物(EPS)組成，如蛋白質(zhì)、胞外多糖、脂質(zhì)和細(xì)胞外DNA，生物被膜有利于微生物黏附，能提高細(xì)菌對(duì)外界不良?jí)木车牡挚鼓芰?，同時(shí)增加細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的抗性。多項(xiàng)研究指出，細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性和聚集能力在細(xì)菌早期粘附、生物被膜形成和細(xì)菌定殖過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，細(xì)菌通過(guò)運(yùn)動(dòng)相互聚集，借助EPS粘附更多的游離菌，從而更加有利于生物被膜的形成，同時(shí)細(xì)菌間的聚集可促進(jìn)其粘附，使生物被膜結(jié)構(gòu)更加堅(jiān)固。研究發(fā)現(xiàn)，多酚類物質(zhì)能通過(guò)破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜、減少生物被膜形成、干擾細(xì)菌運(yùn)動(dòng)和聚集能力等發(fā)揮對(duì)細(xì)菌的抑制效果。沒(méi)食子酸可誘導(dǎo)大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的生物被膜特性發(fā)生不可逆變化。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)和肉桂醛衍生物能抑制副溶血弧菌的運(yùn)動(dòng)能力和生物被膜形成。
蝦殼殼聚糖–表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯共聚物(COS-EGCG)0.256 mg/mL能顯著抑制單增李斯特菌的泳動(dòng)和群集。本研究中，1 mg/mL和2 mg/mL的沒(méi)食子酸能顯著抑制溶藻弧菌的運(yùn)動(dòng)性，降低溶藻弧菌的聚集能力，且沒(méi)食子酸溶液濃度越高，溶藻弧菌的運(yùn)動(dòng)性和聚集能力越低；同時(shí)，沒(méi)食子酸能高效抑制生物被。生物被膜是由細(xì)菌分泌的胞外多聚物(EPS)組成，如蛋白質(zhì)、胞外多糖、脂質(zhì)和細(xì)胞外DNA，生物被膜有利于微生物黏附，能提高細(xì)菌對(duì)外界不良環(huán)境的抵抗能力，同時(shí)增加細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的抗性。多項(xiàng)研究指出，細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性和聚集能力在細(xì)菌早期粘附、生物被膜形成和細(xì)菌定殖過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，細(xì)菌通過(guò)運(yùn)動(dòng)相互聚集，借助EPS粘附更多的游離菌，從而更加有利于生物被膜的形成，同時(shí)細(xì)菌間的聚集可促進(jìn)其粘附，使生物被膜結(jié)構(gòu)更加堅(jiān)固。研究發(fā)現(xiàn)，多酚類物質(zhì)能通過(guò)破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜、減少生物被膜形成、干擾細(xì)菌運(yùn)動(dòng)和聚集能力等發(fā)揮對(duì)細(xì)菌的抑制效果。沒(méi)食子酸可誘導(dǎo)大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的生物被膜特性發(fā)生不可逆變化。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)和肉桂醛衍生物能抑制副溶血弧菌的運(yùn)動(dòng)能力和生物被膜形成。蝦殼殼聚糖–表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯共聚物(COS-EGCG)0.256 mg/mL能顯著抑制單增李斯特菌的泳動(dòng)和群集。本研究中，1 mg/mL和2 mg/mL的沒(méi)食子酸能顯著抑制溶藻弧菌的運(yùn)動(dòng)性，降低溶藻弧菌的聚集能力，且沒(méi)食子酸溶液濃度越高，溶藻弧菌的運(yùn)動(dòng)性和聚集能力越低；同時(shí)，沒(méi)食子酸能高效抑制生物被膜的形成，4 mg/mL和8 mg/mL濃度的沒(méi)食子酸對(duì)溶藻弧菌生物被膜形成的抑制率可達(dá)77.80%和83.26%，對(duì)成熟溶藻弧菌生物被膜的清除率分別為67.54%和68.01%，表明沒(méi)食子酸可能通過(guò)抑制溶藻弧菌的運(yùn)動(dòng)和聚集能力來(lái)抑制生物被膜的形成。生物被膜消除后，細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的抵抗力將顯著下降，當(dāng)沒(méi)食子酸與抗生素聯(lián)用時(shí)，可增加后者在大腸埃希氏菌菌體內(nèi)累積而表現(xiàn)出抗生素增效劑作用。沒(méi)食子酸也可通過(guò)破壞細(xì)胞膜完整性和調(diào)控ica基因家族而發(fā)揮抗菌作用，這種獨(dú)特的抗菌機(jī)制幾乎不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。因此，沒(méi)食子酸不僅可作為一種抗菌效果較好的藥物添加劑使用，還可能作為一種抗菌增效劑聯(lián)合抗生素進(jìn)行疾病的治療。
結(jié)論
沒(méi)食子酸對(duì)溶藻弧菌的抑菌效果較好，可以通過(guò)破壞溶藻弧菌細(xì)胞壁，增加細(xì)胞膜通透性，抑制生物被膜的形成，清除成熟的生物被膜，通過(guò)抑制溶藻弧菌的運(yùn)動(dòng)和聚集能力抑制或殺滅溶藻弧菌，此研究結(jié)果將為水產(chǎn)動(dòng)物弧菌感染性疾病的防治提供新的思路。
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