牛A群輪狀病毒(Bovine Rotavirus A，BRVA)是新生犢牛急性腹瀉的主要病原之一，給養(yǎng)牛業(yè)的帶來了巨大的損失。目前預(yù)防牛輪狀病毒的主要策略是通過給懷孕母牛接種疫苗，將母源抗體傳遞給新生犢牛產(chǎn)生被動(dòng)免疫，但目前我國目前尚無商品化的疫苗。
本研究的目的是研究我國牛A群輪狀病毒優(yōu)勢分離株SDA2毒株對小鼠的免疫原性，為國內(nèi)犢牛腹瀉防治提供技術(shù)支持。
本研究取得的主要結(jié)果如下:
1、SDA2毒株培養(yǎng)條件的優(yōu)化
牛A群輪狀病毒的基因型有很多，但同型毒株對異型毒株不能產(chǎn)生有效的保護(hù)作用，前期的流行病學(xué)資料表明G6P1型牛輪狀病毒是我國優(yōu)勢的基因型。本實(shí)驗(yàn)的目的是對本實(shí)驗(yàn)室分離純化的G6P1型輪狀病毒SDA2毒株的培養(yǎng)的細(xì)胞系進(jìn)行篩選、病毒接種量及收毒時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，從而提高病毒的產(chǎn)量。結(jié)果在其他培養(yǎng)相同條件下培養(yǎng)19 h后，SDA2在Vero細(xì)胞培養(yǎng)物中的CT值為34.214±0.557，在MA104中的CT值為15.121±1.219，表明SDA2毒株在MA104細(xì)胞上增殖效率顯著高于Vero細(xì)胞。在25 cm細(xì)胞瓶中用400μL、600μL、800μL、1000μL四個(gè)病毒接種量分別接種MA104細(xì)胞，孵育1 h后棄去病毒液加入5 mL維持液，培養(yǎng)19 h后收集病毒液，采用熒光定量RT-PCR進(jìn)行定量，四個(gè)接種量細(xì)胞培養(yǎng)物中病毒荷載量分別為2.39×10、2.39×10、2.39×10、2.39×10，結(jié)果表明接種800μL(8×10TCID)病毒液為最佳。采用熒光定量RT-PCR分別對MA104細(xì)胞上接種SDA2后10個(gè)時(shí)間點(diǎn)(4、8、12、16、20、24、28、32、36和40 h)的細(xì)胞培養(yǎng)物中病毒進(jìn)行定量，并繪制病毒的一步生長曲線。
結(jié)果顯示接種后第4～28h病毒荷載量較少，隨后病毒荷載量緩慢增加，第28 h病毒開始大量增殖，36 h達(dá)到峰值，病毒荷載量為2.39×10，36～40h病毒荷載量維持穩(wěn)定變化不大。根據(jù)本研究數(shù)據(jù)，病毒接種后36小時(shí)病毒荷載量達(dá)到最大，為后續(xù)疫苗研制作中抗原生產(chǎn)提供了可靠依據(jù)。
2、G6P1牛輪狀病毒滅活疫苗對小鼠免疫原性的研究將病毒滴度測定
為10TCID/0.1mL的病毒液用β-丙內(nèi)酯滅活，采用201佐劑乳化制成滅活疫苗，按0.2mL/只、0.5mL/只、1.0mL/只的劑量進(jìn)行分組接種小鼠，一免后間隔14 d以相同的劑量加強(qiáng)免疫，二免后每隔7天眼底靜脈采血至42 d，對6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的小鼠血清抗體進(jìn)行監(jiān)測。本實(shí)驗(yàn)將0.5mL組二免28天的小鼠血清稀釋成6份待檢血清，分別進(jìn)行中和試驗(yàn)和間接ELISA檢測，進(jìn)行相關(guān)性驗(yàn)證并利用SPSS軟件建立線性方程，結(jié)果兩者之間相關(guān)性系數(shù)為0.997，說明中和試驗(yàn)結(jié)果與ELISA檢測結(jié)果有著顯著的相關(guān)性，間接ELISA可用來代替中和試驗(yàn)對小鼠血清抗體進(jìn)行檢測，并且中和試驗(yàn)測得0.5mL組小鼠二免28天中和抗體效價(jià)為1:3556，表明本實(shí)驗(yàn)的疫苗可以產(chǎn)生較高水平的中和抗體。
用間接ELISA對二免后小鼠抗BRVA抗體進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示二免后7d、14d、21d、28d、35d、42d，0.2mL組小鼠血清抗體效價(jià)分別為1:348±49.05、1:540±45.03、1:1440±50.70、1:1872±72.72、1:1535±58.66、1:981±54.18，0.5mL組小鼠血清抗體效價(jià)分別為1:680±52.47、1:1672±58.90、1:2860±63.75、1:3556±61.72、1:3926±63.35、1:2142±63.65，1.0mL組小鼠血清抗體效價(jià)分別為1:524±47.59、1:1492±50.16、1:2750±61.16、1:3672±100.44、1:4018±66.99、1:2251±88.93。
結(jié)果顯示，0.2 mL組血清抗體水平明顯低于其它兩組，血清抗體在第28d達(dá)到峰值1:1872±72.72;0.5mL組小鼠和1.0 mL組小鼠血清抗體水平從7d到35d上升，并且在第35d達(dá)到峰值分別為1:3926±63.35和1:4018±66.99，0.5 mL組在第二次免疫后7 d到21 d抗體水平略高于1.0 mL，28d到35d兩組抗體水平逐步持平，結(jié)果表明抗原含量對抗體水平有影響，在一定范圍內(nèi)抗體水平隨抗原量的增加而上升，該結(jié)果還表明在小鼠上的最佳劑量為0.5 mL/只。
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