牛腸道病毒（Bovine enterovirus，BEV）屬于小RNA病毒科、腸道病毒屬，病毒粒子呈球形，無囊膜，直徑30~40 nm。BEV為不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，基因組全長約7500 nt，包括5'非編碼區(qū)（5'untranslated region，5'UTR）、一個開放閱讀框（open reading frame，ORF）及3'非編碼區(qū)（3'untranslated region，3'UTR）。ORF編碼一個大的多聚蛋白，經(jīng)過一系列酶解后產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2、VP3和VP4）和非結(jié)構(gòu)蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D）。
BEV感染牛一般引起輕度的腹瀉癥狀，也可侵犯其他器官而引起呼吸系統(tǒng)疾病或流產(chǎn)，同時存在隱性感染。從患腹瀉、肺炎、呼吸系統(tǒng)疾病及生殖障礙疾病的牛分泌物或排泄物中可分離獲得BEV，也可以從正常牛的糞便樣品中分離出。
1959年Moll和Davis首次分離獲得BEV，隨后很多國家和地區(qū)相繼報道了BEV的分離鑒定。國外牛群中BEV的血清學陽性率為17.6%~80%。中國有關(guān)BEV的病原學及流行病學調(diào)查相對較少。2011年李英利等首次在中國國內(nèi)報道了牛腸道病毒的分離鑒定，隨后又從北京市分離到1株牛腸道病毒。2013年彭小薇等從北京市某牛場嚴重腹瀉的泌乳奶牛直腸拭子中分離獲得1株牛腸道病毒，并進行了全基因組序列測定。2013年第九次病毒分類報告將BEV重新分類為EV-E與EV-F。分子進化樹分析表明以上2株牛腸道病毒中國分離株（BHM-26、BJ50和BJ001）均為EV-F2。2014年邢澤黎等從吉林省肉牛場新發(fā)疫病分離出E種腸道病毒。2015年張海麗等從山西省某奶牛場的泌乳奶牛糞便樣品中分離得到1株牛腸道病毒，分析其可能為EV-E。
本實驗室2017年1月從內(nèi)蒙古發(fā)生呼吸道疾病的某牛場采集牛鼻拭子，用MDBK細胞進行病毒分離，獲得1株病毒。經(jīng)電鏡觀察、理化特性鑒定和序列分析表明該分離株為牛腸道病毒，命名為NM575，這是國內(nèi)首次從表現(xiàn)呼吸道疾病的牛鼻拭子中分離到牛腸道病毒。
1材料和方法
1.1病料
內(nèi)蒙古某牛場發(fā)生呼吸道疾病，病牛表現(xiàn)精神沉郁、流涕、咳嗽和呼吸窘迫等癥狀。采集30頭牛的鼻拭子于含3%小牛血清的MEM中，冰袋保存并迅速運回實驗室。
1.2主要試劑
MDBK細胞由本實驗室保存；基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購自AXYGEN公司；反轉(zhuǎn)錄酶和pMD18-T載體購自TaKaRa公司；dNTP、DEPC水、DNA Marker（DL2000）均購自Thermo公司。
1.3樣品處理與病毒分離
將鼻拭子浸出液經(jīng)0.45μm濾器過濾后接種于24孔板培養(yǎng)的MDBK單層細胞，每孔100μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h后換液，逐日觀察細胞病變（cytopathic effect，CPE）。未出現(xiàn)CPE的盲傳3代后，出現(xiàn)CPE后繼續(xù)傳代，當CPE達到80%時收毒，－70℃保存。
1.4病毒含量的測定（TCID50）
將分離株F4用維持培養(yǎng)液稀釋至10-9，每個稀釋度做8個重復，接種96孔細胞培養(yǎng)板中的MDBK細胞（100μL/孔），并設(shè)正常細胞對照，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察細胞病變，共培養(yǎng)4 d，記錄細胞病變孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench法計算TCID50。
1.5電鏡觀察
將分離病毒接種MDBK細胞，待80%出現(xiàn)CPE后反復凍融3次收毒，2400×g離心15 min，取上清，再經(jīng)4℃、13 800×g離心30 min，取沉淀，2%磷鎢酸負染，進行電鏡觀察。
1.6病毒的理化特性鑒定
對該病毒進行核酸型鑒定、乙醚敏感性試驗、氯仿敏感性試驗、胰蛋白酶敏感性試驗、耐熱性試驗、耐酸性試驗等理化特性鑒定。
1.6.1病毒的核酸型鑒定
將MDBK傳至96孔板，待其長至單層，將已知的RNA病毒牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3）和DNA病毒牛傳染性鼻氣管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）與分離的病毒NM575，分別用含100μg/mL的DNA抑制劑5-溴脫氧尿苷（BRDU）的維持液稀釋至100 TCID50，然后接種至MDBK細胞，同時設(shè)100μg/mL BRDU細胞對照組。每日觀察CPE，48 h后收獲細胞培養(yǎng)物，反復凍融3次后，接種至96孔板上長至單層的MDBK細胞，48 h后記錄CPE情況并計算TCID50。
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