氨基甲酸乙酯，也稱為EC和氨基甲酸乙酯，是食品和飲料加工和發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。它被認為是加工污染物，因為它被歸類為2A致癌物，并且可能對人類致癌。食品飲料發(fā)酵過程中EC的形成途徑主要包括兩條途徑：微生物代謝精氨酸生成EC和乙醇與氰苷反應生成EC。因此，目前降低EC濃度的策略包括抑制EC形成的前體（精氨酸和氰苷）和直接降解EC。球形賴氨酸芽孢桿菌MT33可以降解葡萄酒中高達60%的EC。因此，篩選能夠降解EC的菌株是降低EC濃度的一種有前景的方法。
在美國食品和藥物管理局的一份關于酒精飲料的報告中，大多數(shù)樣品中的EC濃度低于100μg/L，而雪利酒中的EC濃度超過500μg/L。此外，蒸餾酒通常比葡萄酒和啤酒含有更多的EC。許多國家制定了限制酒精飲料中EC的法規(guī)和建議；例如在加拿大，清酒中允許的EC濃度低于200微克/升，而蒸餾酒中允許的EC濃度低于150微克/升；在美國蒸餾酒中EC濃度的允許限值小于125μg/L；在歐洲，捷克共和國和法國的蒸餾酒中的EC限值低于150μg/L。中國白酒是世界上最古老、最受歡迎的蒸餾酒之一，其EC含量很高，必須加以控制。
目前大多數(shù)研究都集中在EC緩解策略上。在本研究中，我們的目的是篩選能夠直接降解EC的菌株。在這里，研究人員報道了兩種乙醇假絲酵母菌株（J1和J116），從發(fā)酵谷物中分離出來，可以直接降低EC濃度。這兩種酵母使用EC作為唯一碳源生長，并且它們在不同的碳源上生長良好。值得注意的是，經(jīng)過殼聚糖固定化后，兩株菌株在24 h內(nèi)對白酒中EC的降解率分別為42.27%和27.91%，優(yōu)于現(xiàn)有的性能。非固定化菌株。此外，通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術研究，揮發(fā)性有機化合物含量并不影響中國白酒的主要風味物質(zhì)。因此，酵母J1和J116有可能用于中國白酒的處理和商業(yè)化。
Bioscreen全自動微生物生長曲線分析儀的應用
將所制備的補充有0g/L、5g/L和10g/L EC的YNB培養(yǎng)基的孔用108 CFU/mL的分離菌株接種并在28℃下孵育。使用Bioscreen C全自動生長曲線分析儀在600 nm(OD 600)處測量分離菌株的生長。每個含有300μL培養(yǎng)基（YNB，0 g/L、5 g/L和10 g/L EC）的微孔板接種10μL接種物。將微孔板在28℃下孵育48小時，并且每小時監(jiān)測每個微孔板孔的OD 600。每次測量前將微孔板搖動10秒。在每個測定中對每個條件進行三個重復孔。
實驗結(jié)果
本研究的目是篩選能夠直接降解EC的菌株。結(jié)果從發(fā)酵谷物中分離出兩種乙醇假絲酵母菌株，命名為J1和J116。這兩個菌株能夠以10 g/L EC作為唯一碳源生長（OD 600高達0.73和0.68）并且很好地同化了不同的碳源。此外，固定化菌株J1可將白酒中的EC濃度從253.03±9.89μg/L降低至146.06±1.67μg/L（降低42.27％），而固定化菌株J116將其降低至182.42±5.05μg/L（降低27.91％）。24小時內(nèi)。這些結(jié)果優(yōu)于非固定化J1和J116獲得的結(jié)果。此外，固定化J1和J116處理后VOC含量略有變化。然而導致EC含量降低的許多其他因素仍有待研究，例如J1和J116降低中國白酒中EC濃度的具體機制以及VOC含量變化的原因。
圖1、以EC為碳源生長的菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。在這些菌株中，J6、J9、J21、J22和J78被鑒定為畢赤酵母(Pichia manshurica)、畢赤酵母(Pichia galeiformis)和畢赤酵母(Pichia sp)。菌株J34和J40分別與近平滑念珠菌分離株Y1和近平滑念珠菌培養(yǎng)物CBS:2215表現(xiàn)出最高的同源性。菌株J128與拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)分離株ML3表現(xiàn)出最高的同源性。其余分離株與乙醇假絲酵母分離株ZJ-21、乙醇假絲酵母分離株A37.4、乙醇假絲酵母菌表現(xiàn)出最大的同源性分離株41和乙醇假絲酵母分離株3-1-19。藍色箭頭顯示選擇用于進一步研究的菌株（J1、J10、J14、J34、J53、J78、J116、J128）。
圖2、J1、J10、J14、J34、J53、J78、J116和J128的碳源同化。通過選擇菌株J1、J10、J14、J34、J116和J128進行生長曲線分析。研究表明從玉米芯中提取的酵母優(yōu)先使用葡萄糖，其次是木糖和阿拉伯糖，同時可以高選擇性地高效利用甘油生產(chǎn)阿拉伯糖醇，并且體積生產(chǎn)率從0.13 g/Lh提高到0.33 g/Lh。
圖3、J1、J10、J14、J34、J116和J128分離菌株的生長曲線。測量生長曲線48小時。這些培養(yǎng)基的濃度制備為0、5和10g/L?；揖€表示0 g/L，黃線表示5 g/L，藍線表示10 g/L。根據(jù)OD 600值，J1和J116在不同濃度EC存在下表現(xiàn)出較強的活力，而J10、J14、J34和J128生長較差。對于J10，對照組的OD 600(0.64)優(yōu)于使用EC(5 g/L和10 g/L)作為碳源時的OD 600(分別為0.38和0.34)。對于J14和J34菌株，OD 600沒有碳源和EC作為碳源處理48小時后，沒有顯著變化（分別約為0.32和0.38）。J128生長得不好。對數(shù)生長期和滯后期不明顯，OD 600值不高（僅0.43）。酵母J128在5 g/L EC培養(yǎng)基中比在10 g/L EC培養(yǎng)基中生長得更好。
圖4、固定化J1、J1和固定化J116、J116處理24 h后白酒的EC濃度。這些系統(tǒng)中EC濃度在24小時內(nèi)顯著下降。與非固定化菌株不同，殼聚糖固定化J1和J116的EC降解能力顯著提高。J1的降解率為非固定化菌株的2倍，固定化J116的降解率為非固定化菌株的1.47倍。
圖5、固定化J1、固定化J116在室溫下處理24小時后中國白酒中揮發(fā)性有機化合物的熱圖。18種酯和5種有機酸的熱圖在右側(cè)以不同的顏色顯示。紅色代表對照組。綠色代表固定的J1基團。藍色代表固定的J116基團。
總結(jié)
氨基甲酸乙酯(EC)是食品和飲料發(fā)酵過程中產(chǎn)生的2A類致癌物，主要存在于蒸餾酒中。目前，大多數(shù)研究都集中在EC緩解策略上。本研究中研究人員的目標是降低發(fā)酵蒸餾酒中的EC含量。為此研究人員從發(fā)酵谷物中篩選出能夠利用EC作為碳源生長的菌株，并驗證了它們直接降解中國白酒中EC的能力。同時，由于白酒中的高濃度乙醇和酸性環(huán)境限制了菌株降解EC的能力，我們采用殼聚糖固定化菌株，并比較固定化對白酒中EC含量的影響。此外還檢測了固定化菌株處理前后中國白酒VOC含量的變化。本研究篩選的菌株將有利于進一步研究其作用機制和中國白酒的商業(yè)化。
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