果膠桿菌(P.carotovorumsubsp.carotovorum)是一種危害廣泛的植物病原菌，能夠侵染白菜類蔬菜、馬鈴薯、胡蘿卜、洋蔥、辣椒、大蒜、人參、君子蘭、魔芋、郁金香、馬蹄蓮等植物，破壞力強，危害較大。目前，國內(nèi)外對果膠桿菌的致病機理以及抑制方法研究較少。二氧化氯是國際上公認的最新一代的高效、廣譜、安全的殺菌劑和保鮮劑，具有適應面廣、使用劑量低、效果好、反應快、無毒、無副作用等優(yōu)點，但是二氧化氯對果膠桿菌的抑制研究鮮有報道。
果膠酶系和纖維素酶系在植物病原菌侵染的過程中起著關鍵作用，可以破壞植物的細胞壁結構，分解利用植物細胞和組織內(nèi)營養(yǎng)成分，引起細胞死亡。本試驗采用二氧化氯處理果膠桿菌，研究二氧化氯溶液對果膠桿菌活力以及致病相關酶活性的影響。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1試驗材料
果膠桿菌(P.carotovorumsubsp.carotovorum)由自然發(fā)病的杭白菜軟腐病病斑上篩選分離得到，純化后于4℃保存，備用。
1.1.2試驗儀器
分光光度計(752紫外可見分光光度計)、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、全自動微生物曲線分析儀、恒溫水浴鍋、電子天平等。
1.1.3培養(yǎng)基配方
二氧化氯(食品級)及其他試劑(分析純)在國藥化學試劑有限公司購買。
LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，用蒸餾水定容至1 000mL，滅菌后備用。
LB固體培養(yǎng)基：依照LB液體培養(yǎng)基，每1.0 L再加入15g瓊脂，滅菌后備用。
細胞壁降解酶誘導培養(yǎng)基：參照Marcus L等的方法。
1.2試驗方法
1.2.1試劑的配制以及標準曲線的制作
(2)取二氧化氯母液和無菌水分別配制濃度為1.01 mgL、4.03 mgL、7.02mgmL的二氧化氯溶液，備用。
還原糖標準曲線的制作：按照表1，分別將試劑加好后搖勻，冷卻至室溫后定容至25 mL，540nm下測定波長。
表1還原糖標準曲線的制作
半乳糖醛酸標準曲線的制作方法與還原糖標準曲線制作方法相同。
1.2.2二氧化氯溶液對果膠桿菌的處理方法
1.2.2.1果膠桿菌生長曲線的測定
將50個錐形瓶裝的LB液體培養(yǎng)基平均分為五組，編碼為A、B、C、D、E組(每組10個平行)，分別加入100μL菌懸液，其中A、B、C、D和E五個處理組再分別加入0 mL、1.28 mL、2.63 mL、4.05 mL和5.56 mL的二氧化氯母液，于25℃下振蕩培養(yǎng)，2h后取出各組的1號錐形瓶即A1、B1、C1、D1、E1放置于4℃冰箱，隨后每隔2h按各組編號從小到大依次取出錐形瓶并放入冰箱，待培養(yǎng)20 h后測定OD值。
1.2.2.2果膠桿菌存活率的測定
將1.2.2.1中培養(yǎng)20 h后的菌懸液分別稀釋至原濃度的10-1、10-2、10-3、10-4，吸取10-3、10-4菌懸液100.0μL，涂布平板，靜置10min后于恒溫培養(yǎng)箱25℃培養(yǎng)36 h，記錄平板上的細菌總數(shù)，按照公式(1)計算細菌存活率。
存活率=處理組細菌總數(shù)/對照組細菌總數(shù)*100%(1)
1.2.2.3果膠桿菌細胞膜透性的測定
取培養(yǎng)3d的菌液10mL在4℃下離心，棄去上清液后，用吸水紙吸取菌體表面的水分，各取1g，離心后菌體放入含有0.25mgL、0.5mgL、0.75mgL、1.0mgL四種濃度二氧化氯的錐形瓶中，用電導儀測定溶液電導率記，為C0，然后在100 rmin、25℃震蕩培養(yǎng)，分別在0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min測定菌體浸出液的電導率，記為Ct。測完后，將所有三角瓶放置于沸水中煮沸15 min，以殺死菌體細胞，待冷卻至25℃后再次測定各電導率值，記為C。根據(jù)公式(2)計算相對電導率值(%)，用相對電導率表示菌體細胞膜的通透性。試驗重復3次，每個處理設5個平行。
相對電導率=（Ct-Co）/C*100%(2)
式中：C0-0min時測定的的電導率值；Ct-各時間測定的電導率值；C-煮沸后測定的電導率值。
1.2.2.4細胞壁降解酶活力的測定
(1)果膠酶(PG)活力測定
取0.5%果膠1.9mL，50℃的條件下預熱10min，加0.1mL酶液，50℃條件下反應30min，加入1.5mL DNS(3,5-二硝基水楊酸，3,5-Dinitrosalicylic acid)，沸水浴5min，定容至25mL，測定540nm下波長。
(2)聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活力測定
取1%果膠1.5mL，30℃的條件下水浴30 min，加入0.5 mL酶液，在30℃的條件下反應30 min，加入1.5 mL DNS，沸水浴5 min，定容至25 mL，測定540 nm下波長。
(3)甲基纖維素酶(CX)活力的測定
取0.51%羧甲基纖維素(CMC)溶液1.5mL，50℃預熱10min后，加入0.5mL酶液，50℃的條件下，反應30min，加入1.5mL DNS，沸水浴5min，定容至25mL，測定540nm下波長。
(4)β-葡萄糖苷酶(GLU)活力測定
1.2.2.5果膠桿菌致病力的測定
取杭白菜葉柄基部切4 cm左右的莖段，75%酒精擦拭消毒，下襯一張無菌濾紙，置于無菌培養(yǎng)皿中，并加入2.0 mL無菌蒸餾水保持濕度。用滅菌小刀在其中心劃2 mm×2 mm的十字型傷口，深度為1.5 mm左右，取10μL的經(jīng)不同濃度二氧化氯氣體處理、濃度為105個mL果膠桿菌菌懸液加入十字形傷口處，重復5次。用封口膜將培養(yǎng)皿封口于25℃培養(yǎng)。每隔3 h觀察其發(fā)病情況，測量病斑長度，每組20個平行處理，并按公式(3)計算發(fā)病率。
發(fā)病率=調(diào)查發(fā)病莖段數(shù)/調(diào)查莖段總數(shù)*100% (3)