近年來，鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium)的致病率呈上升趨勢(shì)，每年造成數(shù)百萬人感染和死亡.沙門菌主要感染腸道，癥狀表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、高燒等，重癥者出現(xiàn)死亡.
外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜(outer membrane,OM)的主要蛋白質(zhì)成分,該類蛋白質(zhì)在調(diào)控細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)、營養(yǎng)獲取、定殖和入侵以及防止抗生素等外部威脅方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用.Heffernan et al研究發(fā)現(xiàn)，Rck基因座與革蘭氏陰性菌中表達(dá)的外膜蛋白家族同源，其中2種與毒力表型相關(guān)：PagC，能提高鼠傷寒沙門菌在巨噬細(xì)胞中的存活率和毒力；Ail，是一種耶爾森氏菌染色體的產(chǎn)物，能夠介導(dǎo)細(xì)菌黏附和侵入上皮細(xì)胞系.Xu et al發(fā)現(xiàn)，OMP的表達(dá)有助于幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)在感染初級(jí)階段附著在胃上皮細(xì)胞上，并能增加該菌的毒力.一些來自不同革蘭氏陰性細(xì)菌的OMP已被確認(rèn)為宿主免疫識(shí)別的重要因素，可參與細(xì)菌多種生命活動(dòng)，具有開發(fā)為疫苗的潛力.
小RNA(small RNA,sRNA)是一類可對(duì)mRNA進(jìn)行調(diào)控的重要因子，參與細(xì)菌多種生命過程，如調(diào)節(jié)毒力、適應(yīng)環(huán)境變化、調(diào)節(jié)OMP基因的表達(dá)等；同時(shí)，sRNA對(duì)mRNA的調(diào)節(jié)作用往往需要伴侶蛋白Hfq參與.Hfq在細(xì)菌生理功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮著多種作用：除了協(xié)同sRNA共同作用外，還能夠單獨(dú)調(diào)節(jié)細(xì)菌多種基因的表達(dá)，對(duì)細(xì)菌生長、毒力、侵襲力等有影響.Sittka et al研究表明,Hfq參與兼性細(xì)胞內(nèi)病原體鼠傷寒沙門菌毒力因子的表達(dá)和分泌.sRNA和Hfq可對(duì)大量的mRNA和蛋白進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而影響細(xì)菌的致病性.
FadL、OmpN、YbfM在沙門菌中均參與外膜蛋白的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、識(shí)別等過程，Hfq及sRNA RybB也被確定能對(duì)以上3個(gè)OMP基因產(chǎn)生一定的調(diào)控作用.但外膜蛋白FadL、OmpN、YbfM及伴侶蛋白Hfq和sRNA RybB對(duì)沙門菌致病性的影響并未完全明確.本試驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的鼠傷寒沙門菌基因缺失菌株ΔompN、ΔfadL、ΔybfM、Δhfq、ΔrybB、ΔrybB&Δhfq研究其對(duì)該菌致病性的影響，旨在為了解這些基因?qū)ι抽T菌致病性的作用機(jī)制提供依據(jù).
1材料與方法
1.1供試菌株
表1缺失菌株基因型
鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株LT2由法國國家科學(xué)研究中心(CNRS)分子遺傳學(xué)Bossi實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；鼠傷寒沙門菌缺失菌株ΔompN、ΔfadL、ΔybfM、Δhfq、ΔrybB、ΔrybB&Δhfq均由貴州省動(dòng)物疫病研究室構(gòu)建.缺失菌株基因型如表1所示.
1.2供試動(dòng)物
無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí)KM系雄性小鼠，18～22 g，4～6周齡，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司.在特定的無病原體條件下養(yǎng)殖小鼠，提供充足的食物和水.試驗(yàn)已通過貴州大學(xué)動(dòng)物倫理和福利委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)：EAE-GZU-2021-E005).
1.3鼠傷寒沙門菌生長曲線的測(cè)定
將鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株LT2及基因缺失菌株ΔompN、ΔfadL、ΔybfM、Δhfq、ΔrybB、ΔrybB&Δhfq分別接種于LB平板中復(fù)蘇培養(yǎng)，挑取平板上單個(gè)菌落接種于液體LB中，37℃搖床中培養(yǎng)過夜.次日，通過紫外分光光度計(jì)(Q-5000)調(diào)整菌株的D600 nm=0.1，按照1∶100的比例取500μL菌液接種于50 mL液體LB中，37℃、170 r·min-1振蕩培養(yǎng)，每隔1 h取1 mL細(xì)菌懸浮液，通過紫外分光光度計(jì)測(cè)D600 nm值.統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并制作生長曲線圖.
1.4鼠傷寒沙門菌的毒力測(cè)定
將鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株LT2及基因缺失菌株ΔompN、ΔfadL、ΔybfM、Δhfq、ΔrybB、ΔrybB&Δhfq分別接種于5 mL液體LB中，37℃搖床中培養(yǎng)過夜.次日，取100μL菌液至新的LB試管中，培養(yǎng)10 h，將菌液12 000 r·min-1離心5 min，棄掉上清液，通過無菌PBS重懸浮洗滌，調(diào)整菌液濃度至1×109CFU·mL-1，再梯度稀釋為1×108、1×107、1×106、1×105CFU·mL-1.將小鼠隨機(jī)分組，每組5只，腹腔注射菌液0.5 mL·只-1，以注射相同劑量PBS為空白組.連續(xù)15 d觀察、記錄小鼠死亡數(shù)，通過改良寇式法計(jì)算各菌株對(duì)應(yīng)的LD50.
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