為了確保食品的微生物質(zhì)量和安全，人們對使用預測模型來量化和預測微生物行為產(chǎn)生了興趣。不同的環(huán)境因素和防腐劑對絲狀真菌的生長前的滯后期和生長速度的影響是不同的。由于絲狀真菌的生長習性，在絲狀真菌特別是產(chǎn)真菌毒素的菌種上進行此類實驗較為困難，本論文的研究的目的就是開發(fā)一種自動比濁儀度法（Bioscreen）快速篩選抗真菌化合物以及其對黃曲霉的初始生長動態(tài)的影響，并利用提出的方法與LPM相聯(lián)系用于最低抑制濃度MIC和非抑制濃度(NIC)值的準確定量來評價抗真菌化合物在不同環(huán)境下對黃曲霉的抑菌作用條件。


全自動生長曲線分析儀的應用


應用全自動生長曲線分析儀Bioscreen測試了絲狀真菌黃曲霉素中加入不同濃度的丙基丙烷硫代磺酸鹽(PTS)后對應的生長曲線圖（OD600），對比了絲狀真菌在不同不同環(huán)境下的生長情況，并計算了它們在不同條件下的對應的O600值上的差異。測試的生長曲線的周期為7天，每隔20分鐘測試一次OD600值，培養(yǎng)過程中各菌株的搖晃、生長及OD值的測試全是自動完成的，從而篩選獲得抗真菌化合物PTS對絲狀真菌黃曲霉素的最低抑制濃度MIC和非抑制濃度(NIC)值。


實驗結果


開發(fā)了一種全自動的比濁度法(Bioscreen C)檢測絲狀真菌黃曲霉在不同環(huán)境條件下的初始生長動態(tài)，此種方法可快速篩選抗真菌化合物，并對其進行生態(tài)生理學研究，并利用所提出的方法與LPM相聯(lián)系用于最低抑制濃度MIC和非抑制濃度(NIC)的計算，可準確定量評價抗真菌化合物在不同環(huán)境下對黃曲霉的抑菌作用效果。研究表明建立的這種比濁度方法對于抗真菌化合物的快速篩選生長和絲狀生物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生的研究具有如縮短時間，所需培養(yǎng)基體積小等重要的優(yōu)勢來比較相關不同抗真菌化合物的療效。

圖1、在含有(A)0.2%和(B)0.125%w/v瓊脂的YES培養(yǎng)基中，接種了105/ml的A.flavus孢子(25 C)，獲得其對應的生長曲線圖。

圖2、含0.125%瓊脂w/v(25 C)的YES培養(yǎng)基中，初始濃度為102-106/ml的孢子的黃曲霉接種后獲得的平均生長曲線圖(10條微生物的個體生長曲線的平均值)

圖3、在Bioscreen C分析儀的100孔的微孔板加載不同體積的菌種后得到的平均生長曲線(10條個體曲線平均值)。接種量為金黃色葡萄球菌105/ml，培養(yǎng)溫度為25℃。

圖4、通過兩次不同接種量的黃曲霉與外源黃曲霉在不同培養(yǎng)時間下的平均生物量比較。培養(yǎng)溫度為20℃。

圖5、不同條件下獲得的絲狀真菌的生長曲線圖(5條個體曲線)，顯示獲得的生長曲線是在不同溫度下，7天后在含有0.125%瓊脂w/v的YES培養(yǎng)基內(nèi)接種具有代表性濃度的PTS，接種濃度為105/ml的黃曲霉孢子。(A)25 C和0.995aw;(B)25 C和0.95aw;(C)20c和0.995aw;(D)20 c和0.995aw。


總結


本論文主要開發(fā)了一種快速篩選抗真菌化合物，并進行生態(tài)生理學研究的高通量方法，利用特殊的半固態(tài)培養(yǎng)基對絲狀真菌進行了研究，采用分光光度/濁度法測量，所使用的儀器設備是Bioscreen C全自動生長曲線分析儀，該儀器結合2塊100孔的微孔板可同時平行測試多個各種菌株樣品的生長曲線，并且所有的過程都是自動化的。本論文的研究人員全面研究了培養(yǎng)基的組成和制備，接種劑的大小，培養(yǎng)基體積和孵育參數(shù)等用于測量初始真菌的萌發(fā)和生長動態(tài)的優(yōu)化，全自動生長曲線分析儀Bioscreen C在本研究工作中主要是用于評估18種濃度的丙基丙烷硫代磺酸鹽(PTS)在不同的環(huán)境下對黃曲霉的抑制作用。研究過程采用了一種以前用于細菌抑制的數(shù)學模型方法，即超過7天的自動化周期培養(yǎng)，每20分鐘測量一次，很好的獲得相關的最低抑制濃度(MIC)，并計算了非抑制濃度(NIC)值。從以上研究可以看出應用全自動生長曲線分析儀Bioscreen分析儀建立的這種篩選抗真菌類的方法對于快速篩選生長和絲狀生物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和利用具有非常好的應用前景，尤其是該設備能夠縮短測試時間，研究所需培養(yǎng)基體積量少，這也說明全自動生長曲線分析儀Bioscreen不僅可用于研究腐敗菌和致病菌，還可用于絲狀真菌病原體的生態(tài)生理學和抗真菌篩選,為相關微生物領域的研究人員在篩選各類微生物提供了重要的技術支持。


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