1.3.5噬菌體對(duì)細(xì)菌生物被膜影響
1.3.5.1細(xì)菌生物被膜形成能力測(cè)定
將過(guò)夜培養(yǎng)的PM B2調(diào)整為105 CFU/mL，取200μL菌液加入到96孔培養(yǎng)板中，37℃靜置培養(yǎng)24、48 h和72 h。孵育后吸出培養(yǎng)基，每孔使用PBS洗滌3次，以去除游離細(xì)菌。每孔加入200μL甲醇，固定15 min后，棄掉甲醇，通風(fēng)干燥5 min，每孔加入200μL結(jié)晶紫，染色15 min。使用緩水流沖洗96孔培養(yǎng)板，以去除結(jié)晶紫染料。室溫通風(fēng)干燥30 min，每孔加入200μL 33%的冰醋酸溶液，靜置20 min。用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD595 nm值。
1.3.5.2噬菌體對(duì)細(xì)菌生物被膜形成抑制能力測(cè)定
按照Li Donghang等的方法測(cè)定噬菌體對(duì)細(xì)菌生物被膜的抑制能力。參考1.3.5.1節(jié)的方法將過(guò)夜培養(yǎng)的PM B2調(diào)整為105 CFU/mL，噬菌體濃度調(diào)整為102～107 PFU/mL。將不同濃度的噬菌體和細(xì)菌均勻混合，使MO?分別為0.001、0.01、0.1、1、10和100。取200μL混合液加入到96孔板中，每個(gè)MO?設(shè)置3個(gè)重復(fù)。對(duì)照組僅添加200μL菌液，空白組僅添加200μL LB培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)48 h。參照1.3.5.1節(jié)的方法，測(cè)定噬菌體對(duì)細(xì)菌生物被膜形成抑制能力。
1.3.5.3噬菌體對(duì)細(xì)菌生物被膜清除能力測(cè)定
參考1.3.5.1節(jié)的方法培養(yǎng)成熟生物被膜。隨后吸出培養(yǎng)基并用無(wú)菌PBS洗滌3次。處理組加入200μL使用LB培養(yǎng)基稀釋的噬菌體液（108 PFU/mL），對(duì)照組加入200μL LB培養(yǎng)基。37℃孵育12、24 h和36 h，孵育后，取出各時(shí)間段的96孔板，使用結(jié)晶紫染色法測(cè)定噬菌體對(duì)生物被膜清除能力。為測(cè)定噬菌體對(duì)生物被膜內(nèi)細(xì)菌的影響，取出各時(shí)間段的96孔板，使用無(wú)菌PBS清洗3次后，刮取生物被膜，使用無(wú)菌PBS連續(xù)稀釋試樣并涂布LB固體平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜并測(cè)定細(xì)菌總數(shù)。
1.3.6噬菌體應(yīng)用
1.3.6.1噬菌體對(duì)不同材料上生物被膜的清除能力
將不銹鋼片和高密度聚乙烯（1 cm×1 cm×0.1 mm）用75%乙醇溶液處理后，高壓滅菌。將材料置于含有20 mL細(xì)菌懸液的50 mL離心管中，培養(yǎng)48 h，使細(xì)菌附著在材料表面。孵育后，使用無(wú)菌PBS沖洗3次，以去除游離細(xì)菌。將處理后的材料分別置于5 mL的噬菌體液（108 PFU/mL）和5 mL的PBS中，37℃孵育0、12、24 h和36 h。孵育后取出材料，使用無(wú)菌PBS沖洗材料表面，隨后將材料放置于含有5 mL PBS的50 mL離心管中，20 kHz超聲10 min并渦旋5 min。使用無(wú)菌PBS連續(xù)稀釋試樣并涂布LB固體平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜并測(cè)定細(xì)菌總數(shù)。
1.3.6.2噬菌體在雞胸肉中的抑菌應(yīng)用
將雞胸肉切成1 g小塊，在75%乙醇溶液中浸泡5 min，并照射紫外線50 min，以確保清除可能存在的細(xì)菌。取100μL PM B2菌液（104 CFU/mL）均勻涂抹于雞胸肉上，放置于培養(yǎng)皿中靜置30 min，以便細(xì)菌附著。隨后，分別加入100μL噬菌體液（107 PFU/mL和108 PFU/mL），使MO?分別為1 000和10 000，對(duì)照組加入100μL SM緩沖液。將處理的食物樣品分別放置于4℃和25℃，并在0、3、6、9 h和12 h取出食物樣品，使用無(wú)菌PBS連續(xù)稀釋試樣并涂布LB固體平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜并測(cè)定細(xì)菌總數(shù)。
1.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析
每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以±s表示，數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 9軟件進(jìn)行方差分析和圖形繪制。P＜0.05時(shí)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
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