黃曲霉菌(Aspergillusflavus)是一種土壤腐殖真菌，玉米、花生等谷類收獲前后都會(huì)腐爛作物的種子。黃曲霉最適生長溫度范圍為25～42℃，其中最適毒素產(chǎn)生溫度為28℃。這些真菌會(huì)導(dǎo)致食物變質(zhì)，甚至還會(huì)產(chǎn)生有劇毒的毒素，其中黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)因其對(duì)肝的毒性和極強(qiáng)的致癌性而備受關(guān)注。動(dòng)物食用含有黃曲霉毒素的谷物，嚴(yán)重情況可導(dǎo)致死亡，人類長時(shí)間食用含低濃度黃曲霉毒素的食物被認(rèn)為是導(dǎo)致胃癌、肝癌、腸癌等疾病的主要原因。黃曲霉毒素對(duì)人類和牲畜造成嚴(yán)重的健康問題，因此超過100多個(gè)國家在食品與飼料中嚴(yán)格限制毒素水平，其中用于人類和奶牛的玉米受到最嚴(yán)格限制，為20/1 000 000 000。近年來，盡管引進(jìn)了新的抗真菌藥物和防腐劑，但是由于耐藥性和環(huán)境污染逐漸增加，尋找安全可靠的抗真菌藥物引起全世界研究者的興趣。
姜黃素(C21H20O6)是從姜黃根莖中提取的小分子量疏水多酚類化合物，也是姜黃的主要成分，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤等廣泛的藥理活性。姜黃素被世界衛(wèi)生組織、聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織歸列為食品添加劑，也是我國在《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2760—1981)中最早頒布的，是在食品中被允許使用的9種天然色素之一。姜黃素作為天然光敏劑，對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、擬莖點(diǎn)霉、灰霉等致病菌均有抑制效果。由于姜黃素良好的抑菌效果，在食品安全領(lǐng)域得到人們的關(guān)注和重視。
1實(shí)驗(yàn)材料和方法
1.1材料和試劑
黃曲霉菌株(JXZS-117-1)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油作物研究所惠贈(zèng);姜黃素(純度≥98%)購自Sigma-Aldrich(St.Louis，USA)。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1孢子萌發(fā)率和芽管長度
在90 mm的培養(yǎng)皿中加入10 mL的PDA，取100μL收集的孢子液并用玻璃涂布棒在平板表面涂抹均勻。放置在28℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12 h。在光學(xué)顯微鏡下觀察萌發(fā)情況。記錄和計(jì)算平板上孢子的芽管長度和萌發(fā)率，萌發(fā)率計(jì)算公式如下:
其中:S1為總的孢子個(gè)數(shù);S2為萌發(fā)的孢子個(gè)數(shù)。
1.2.2抑菌劑對(duì)致病菌生長抑制效果
根據(jù)文獻(xiàn)[11]的方法，將在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d正常生長的黃曲霉使用5 mm打孔器，取菌餅于含0.3 mmol/L的姜黃素PDA的培養(yǎng)皿正中央，在空白對(duì)照組中只加入PDA。將樣品放入28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。觀察并測(cè)量黃曲霉菌落直徑。每個(gè)處理重復(fù)3次，進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。
1.2.3毒素檢測(cè)
在10 mL的試管中加入5 mL的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(potato dextrose broth，PDB)，添加姜黃素使最終濃度為0.3 mmol/L，加入100μL已過濾的5×105個(gè)/mL的黃曲霉孢子液，然后放置在轉(zhuǎn)速為180 r/min、溫度為28℃的恒溫?fù)u床中。在搖床中培養(yǎng)7 d后收集菌絲和培養(yǎng)液。將收集的菌絲在50℃的烘箱中烘干水分并不時(shí)地記錄菌絲質(zhì)量，待質(zhì)量不再變化記錄最終菌絲干重。
將去除菌絲的培養(yǎng)液加入到50 mL的離心管中并加入1 g NaCl，用pH=7的磷酸緩沖液稀釋至25 mL，將溶液震蕩混勻并超聲30 min，過濾備用。準(zhǔn)確量取5 mL濾液加入到免疫親和柱中，然后將免疫親和柱接到5 mL的注射器下，調(diào)整注射器流速使溶液以2 mL/min的流速緩慢流過免疫親和柱，再以2 mL/min的流速用0.1%吐溫/PBS清洗，用10 mL的蒸餾水清洗2次。棄去全部流出的液體，并將3 mL的空氣注入免疫親和柱，再用2 mL的色譜級(jí)甲醇洗脫毒素，收集洗脫液。洗脫液用0.22μm的有機(jī)相過濾器過濾收集。準(zhǔn)確吸取300μL的樣品加入樣品收集瓶中待測(cè)。液相條件為:流動(dòng)相為甲醇和水(體積比為70∶30)，流速1 mL/min，柱溫40℃。熒光檢測(cè)激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm。
計(jì)算單位質(zhì)量菌絲產(chǎn)生的毒素，計(jì)算公式為:
T=10c/m
其中:T為單位菌絲產(chǎn)生的毒素量;c為毒素的檢測(cè)濃度;m為菌絲的干質(zhì)量。
1.2.4洋蔥穿透實(shí)驗(yàn)
準(zhǔn)備一個(gè)新鮮、無損傷的洋蔥，用刀片在內(nèi)表皮上切出一個(gè)邊長1 cm的正方形，用無菌的鑷子剝?nèi)パ笫[的表皮，將撕下的洋蔥內(nèi)表皮裝入含有50 mL無菌水的培養(yǎng)瓶中。密封之后將培養(yǎng)瓶放置在68℃的水浴鍋中加熱1 h以殺死洋蔥細(xì)胞。加熱結(jié)束后使用無菌蒸餾水將內(nèi)表皮清洗2遍，清除表皮上的多余組織。配制5×105個(gè)/mL的黃曲霉孢子液，并在孢子液中加入姜黃素使其濃度為0.3 mmol/L，設(shè)置不含有姜黃素的空白對(duì)照。然后用移液槍取100μL的孢子液加入到洋蔥表皮，將孢子液在表皮涂抹均勻。將處理后的洋蔥表皮放置在培養(yǎng)皿中保濕、避光、室溫下孵育12 h后，加入0.25%的臺(tái)盼藍(lán)染液染色4 min，然后用移液槍小心地除去染液，再吸取無菌蒸餾水吹洗掉剩余的染液。最后制片在普通光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。
1.2.5侵染花生實(shí)驗(yàn)
準(zhǔn)備孢子懸浮液并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，制成5×105個(gè)/mL的孢子液100 mL。將花生粒稱重記錄，用1%的次氯酸鈉浸泡1 min，取出后用無菌水沖洗2次，放置在超凈臺(tái)吹干。將花生放入孢子液中浸泡30 s，取出后放置在含少量無菌水濾紙的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放置在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。對(duì)照組是用未處理的黃曲霉孢子液浸泡，設(shè)置空白對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次，進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。
1.2.6花生感官評(píng)價(jià)
為了評(píng)價(jià)姜黃素的加入對(duì)花生的感官是否會(huì)產(chǎn)生影響，對(duì)加入姜黃素的花生進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。具體操作為:將花生加入到0.3 mmol/L的姜黃素中進(jìn)行浸泡，使用清水浸泡的花生做空白對(duì)照，浸泡結(jié)束后將花生放置在通風(fēng)處晾干，2 d后將部分姜黃素處理的花生進(jìn)行清水清洗。實(shí)驗(yàn)邀請(qǐng)13位人員對(duì)花生進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，通過對(duì)樣品仔細(xì)觀察、嗅聞和品嘗，對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分，具體評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1所列。
表1花生感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)
1.2.7抑菌劑對(duì)病原菌形態(tài)學(xué)的影響
從7 d正常生長的黃曲霉菌板中截取菌餅，加入到含無菌水的培養(yǎng)瓶中，振蕩充分，用兩層擦鏡紙進(jìn)行過濾，取10μL菌液放置在血球計(jì)數(shù)板中進(jìn)行計(jì)數(shù)，獲得5×105個(gè)/mL的孢子液;然后在添加0.3 mmol/L姜黃素的PDA培養(yǎng)皿中，吸取100μL的孢子液加到培養(yǎng)皿中，用玻璃涂布棒將孢子液涂抹均勻，放置在28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d;再將處理后的黃曲霉菌重新提取孢子，加入含姜黃素的平板中，進(jìn)行連續(xù)3代的培養(yǎng)并觀察菌落形態(tài)和色素產(chǎn)生情況。每個(gè)處理重復(fù)3次，進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。
1.2.8黃曲霉菌對(duì)姜黃素的耐受性分析
為了探究黃曲霉菌對(duì)姜黃素的長期處理會(huì)不會(huì)產(chǎn)生耐受性，在含有0.3 mmol/L姜黃素的PDA平板上培養(yǎng)黃曲霉菌，待產(chǎn)孢后觀察菌落形態(tài)并收集孢子，用無菌水過濾黃曲霉孢子，制成5×105個(gè)/mL的黃曲霉孢子懸浮液;取100μL孢子懸浮液加入到含姜黃素和不含姜黃素的PDA板中，然后用玻璃涂布棒涂抹均勻。將接種好的平板放置在28℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)7 d。第7天收集平板上的孢子過濾，得到第1代姜黃素處理的孢子液;繼續(xù)將得到的孢子液在姜黃素處理的平板中連續(xù)培養(yǎng)3代，獲得第3代姜黃素處理后的黃曲霉孢子。然后使用第3代孢子進(jìn)行花生侵染實(shí)驗(yàn)。每個(gè)處理重復(fù)3次，進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。
1.3數(shù)據(jù)分析
所得數(shù)據(jù)使用Excel 2013進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，并用SPSS 17.0進(jìn)行方差分析(ANOVA)，計(jì)算平均值之間是否存在顯著性差異用Duncan多重檢驗(yàn)法，P<0.05認(rèn)為差異顯著，不同字母表示不同處理之間具有顯著性差異。文中柱狀圖使用Origin 8.0進(jìn)行繪制。
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