長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)農(nóng)業(yè)采用粗放生產(chǎn)模式和高投入的水肥管理，造成土壤養(yǎng)分比例失調(diào)和生物多樣性單一，連作障礙問(wèn)題日益突出，對(duì)我國(guó)設(shè)施蔬菜可持續(xù)發(fā)展造成嚴(yán)重威脅。其中由植物病原真菌引起的土傳病害是限制生產(chǎn)的主要因素，嚴(yán)重影響蔬菜產(chǎn)量和品質(zhì)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
茄病鐮刀菌（Fusarium solani）作為引發(fā)黃瓜根腐病的病原菌之一，主要侵染植株根部，導(dǎo)致根部出現(xiàn)水漬狀腐爛，失去吸收水分及養(yǎng)分的能力，最終導(dǎo)致植株死亡，造成黃瓜產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。研究表明，西藏設(shè)施西（黃）瓜根腐病原菌為茄病鐮刀菌；而劉洋研究也表明，茄病鐮刀菌瓜類專化型（Fusarium solani f.sp.cucurbitae）會(huì)引起嫁接的黃瓜根莖腐病。因此，解決由茄病鐮刀菌引起的根腐病對(duì)黃瓜生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。
目前，化學(xué)防治可有效防治土傳病害，但其價(jià)格高，高毒殘留嚴(yán)重影響人類健康和自然環(huán)境，并且病害和農(nóng)藥用量不斷增加的惡性循環(huán)嚴(yán)重破壞生態(tài)平衡。使用植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria,PGPR）和生物防治劑（biocontrol agents,BCAs）是防控根腐病的一種替代方法，利用有益微生物或微生物分泌的代謝產(chǎn)物，通過(guò)直接或間接機(jī)制抑制病原體生長(zhǎng)，有利于促進(jìn)作物健康生長(zhǎng)。芽孢桿菌屬的菌株因其營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單、繁殖生長(zhǎng)快、代謝產(chǎn)物豐富、可產(chǎn)抗逆性芽孢等特點(diǎn)而具有顯著的生防潛力，成為研發(fā)生防菌劑的理想菌株。Kim等分離得到一株產(chǎn)多肽的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）PT14-4a，對(duì)茄病鐮刀菌具有顯著的抑制作用；枯草芽孢桿菌（B.subtilis）SPB1對(duì)茄病鐮刀菌有較強(qiáng)抑菌活性；楊曉燕等發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對(duì)多種致病菌有良好的拮抗效果，其中包括茄病鐮刀菌。此外，芽孢桿菌還表現(xiàn)出促進(jìn)植株生長(zhǎng)的效果，Anjum等發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌的施用增加了甜瓜植株根干重和莖重；枯草芽孢桿菌QST713可促進(jìn)黃瓜植株生長(zhǎng)，尤其是株高和干重的增加；此外，解淀粉芽孢桿菌GB03可促進(jìn)木薯地上部和根系生長(zhǎng)。
本研究以黃瓜茄病鐮刀菌作為靶標(biāo)真菌，從設(shè)施黃瓜根際抑病土中分離篩選對(duì)茄病鐮刀菌有抑制效果的芽孢桿菌，對(duì)3個(gè)拮抗作用顯著的菌株進(jìn)行形態(tài)觀察、生理生化分析和分子生物學(xué)鑒定以明確其分類地位，并對(duì)3個(gè)菌株進(jìn)行了盆栽試驗(yàn)，探究其對(duì)黃瓜幼苗根腐病的防控效果及對(duì)植株生長(zhǎng)特性的影響，為有效防控黃瓜根腐病發(fā)生和黃瓜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供了有潛力的生防資源和理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料
供試黃瓜品種為‘德?tīng)?9’，種子購(gòu)買自天津德瑞特種業(yè)有限公司。土壤樣品采集自寧夏中衛(wèi)市及吳忠市日光溫室設(shè)施黃瓜根際。供試黃瓜根腐病病原菌茄病鐮刀菌（F.solani）由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。
培養(yǎng)基：NA培養(yǎng)基用于拮抗菌的分離和培養(yǎng)；PDA培養(yǎng)基用于真菌培養(yǎng)及拮抗細(xì)菌的篩選；PDB培養(yǎng)基用于病原真菌液體培養(yǎng)；LB肉湯培養(yǎng)基用于拮抗細(xì)菌的液體培養(yǎng)。
1.2方法
1.2.1芽孢桿菌的分離
稱取10 g土壤樣品至裝有90 mL無(wú)菌水的三角瓶中振蕩使之充分懸浮，懸浮液置于80℃水浴20 min以殺死絕大部分非芽孢桿菌，將土壤懸浮液稀釋至10-3、10-4，10-5濃度，吸取100μL至NA平板涂布均勻，倒置于30℃恒溫箱中培養(yǎng)2 d后，選擇具有不同形態(tài)的菌落劃線純化3次。
1.2.2拮抗菌株的篩選
采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法篩選出對(duì)黃瓜茄病鐮刀菌有抑制作用的菌株。初篩：用直徑為5 mm的打孔器在茄病鐮刀菌平板邊緣打取病原菌菌餅接入PDA平板中央，并在菌餅周圍等距離25 mm處點(diǎn)接待測(cè)的菌株。以只接種病原菌作對(duì)照，重復(fù)3次，28℃培養(yǎng)7 d后記錄病原菌直徑并計(jì)算抑菌率。
選擇初篩抑菌率高于50%的菌株使用其培養(yǎng)液進(jìn)行復(fù)篩。將直徑為5 mm的茄病鐮刀菌菌餅接入PDA平板中央，然后在距中心25 mm處打孔，接入200μL細(xì)菌培養(yǎng)上清液（挑取一環(huán)純菌接種在裝有10 mL LB液體培養(yǎng)基三角瓶中，30℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，10 000 r/min離心5 min）。以空白培養(yǎng)基作對(duì)照，重復(fù)3次，28℃培養(yǎng)7 d后記錄病原菌直徑，并計(jì)算抑菌率。
抑菌率（%）=（對(duì)照病原菌菌落直徑-處理病原菌菌落直徑）/（對(duì)照病原菌菌落直徑-病原菌菌餅的初始直徑）×100%
1.2.3拮抗菌株的鑒定
1.2.3.1菌株的形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定
將復(fù)篩后拮抗效果最好的3個(gè)菌株劃線在NA平板上置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行菌落形態(tài)觀察和生理生化等特征分析。
1.2.3.2菌株的抗病促生特性測(cè)定
固氮能力：將待測(cè)菌株接種到阿須貝培養(yǎng)基，培養(yǎng)觀察其有無(wú)菌體生長(zhǎng)。溶磷能力：將待測(cè)菌株接種于固體無(wú)機(jī)溶磷培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)觀察其有無(wú)透明溶磷圈出現(xiàn)。解鉀能力：將待測(cè)菌株接種到硅酸鹽培養(yǎng)基上，培養(yǎng)觀察其有無(wú)透明圈出現(xiàn)。產(chǎn)鐵載體：將待測(cè)菌株接種到鉻天青CAS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)觀察有無(wú)黃綠色暈圈出現(xiàn)。ACC脫氨酶活性：將菌株接種到ADF液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，將培養(yǎng)所得菌液涂布于ADF固體平板，30℃培養(yǎng)后觀察ADF平板上有無(wú)菌落生長(zhǎng)，有菌落生長(zhǎng)則具有ACC脫氨酶活性，反之則無(wú)。根據(jù)要雅倩等的方法進(jìn)行蛋白酶、果膠酶、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶活性的檢測(cè)。
1.2.3.3菌株的分子鑒定
挑取單菌落接種于LB肉湯培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)24 h后，采用DNA提取試劑盒提取菌株的總DNA，使用細(xì)菌通用引物（27F:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'和1492R:5'-CTACGGCTA CCTTGTTACGA-3'）擴(kuò)增各菌株的16S rDNA基因序列，PCR反應(yīng)體系（50μL）：菌落（基因組DNA）1μL，上下游引物（27F和1492R）各1μL，ddH2O 22μL，MIX（2×Phanta Max Master Mix）25μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，68℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)；參照Cao等方法，使用特異性引物gyrA：（L-AAATCTGCCCGTATCGTCG,R-GCGTCACGGCGRATCTCAA）、rpoA：（L-CGTAGAGCCACTTGAGCG,R-CTGCCGTTACAGTTCCTT）進(jìn)行基因擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物回收后送北京擎科生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)得的菌株序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST對(duì)比，使用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
1.2.4菌株的促生試驗(yàn)
試驗(yàn)在中國(guó)銀川市寧夏大學(xué)實(shí)訓(xùn)基地進(jìn)行。育苗基質(zhì)（河北德沃多肥料有限公司）的基本性質(zhì)：pH 6.75，EC 0.91 mS/cm，有機(jī)質(zhì)40.71 g/kg，全氮0.70 g/kg，速效氮27.44 mg/kg，速效磷15.43 mg/kg，速效鉀66.97 mg/kg。基質(zhì)連續(xù)滅菌（121℃，20 min）3次后降至室溫備用。將消毒后的黃瓜種子溫湯浸種催芽，待露白后播種至72孔穴盤，于幼苗兩葉一心時(shí)用20 mL菌株培養(yǎng)液（108 CFU/mL）灌根處理，CK1為20 mL清水灌根，每個(gè)處理15株，重復(fù)3次，接種10 d后對(duì)植株的生長(zhǎng)特性指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。
1.2.5菌株的盆栽防效試驗(yàn)
于幼苗兩葉一心時(shí)分別先用20 mL拮抗菌培養(yǎng)液灌根處理，24 h后接種茄病鐮刀菌懸浮液（104 CFU/mL），不同濃度的處理設(shè)置為CK2：20 mL清水灌根、T1：原液，濃度108 CFU/mL、T2：10倍稀釋液，濃度107 CFU/mL、T3：100倍稀釋液，濃度106 CFU/mL。每個(gè)處理15株，重復(fù)3次。接種10 d后對(duì)植株的生長(zhǎng)特性指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，調(diào)查發(fā)病情況，病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)，并計(jì)算病情指數(shù)和防病效果。
淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌抑制茄病鐮刀菌效果顯著，可促進(jìn)黃瓜幼苗生長(zhǎng)（一）
淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌抑制茄病鐮刀菌效果顯著，可促進(jìn)黃瓜幼苗生長(zhǎng)（二）
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