1.2.4生理生化試驗(yàn)
對(duì)分離得到的乳酸菌進(jìn)行生理生化特性鑒定，具體步驟參照《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》。將菌株接種培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行吲哚試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)等。
1.2.5溫度試驗(yàn)
于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株24 h后，以2.0%的接種量進(jìn)行傳代，分別于20、25、30、37、40和45℃恒溫厭氧箱內(nèi)培養(yǎng)，取其在培養(yǎng)0、1、2、3、4、5、6、8、10、12、14、24、36、48 h時(shí)的菌懸液測(cè)定600 nm處吸光度(OD600)值，每組設(shè)置3個(gè)平行。最終結(jié)果以每組平均值為標(biāo)準(zhǔn)繪制統(tǒng)計(jì)圖。
1.2.6產(chǎn)酸、耐酸性能試驗(yàn)
將培養(yǎng)24 h的菌懸液以2.0%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)。分別于0、2、4、6、8、10、12、14、24 h利用pH計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液pH，根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制產(chǎn)酸速率曲線。
將培養(yǎng)24 h的菌懸液以2.0%的接種量分別接種于不同初始pH(1、2、3、4、5、6、7)的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)，取其在培養(yǎng)0、3、6、12 h時(shí)的菌懸液測(cè)定OD600值，每組設(shè)置3個(gè)平行。最終結(jié)果以每組平均值為標(biāo)準(zhǔn)繪制統(tǒng)計(jì)圖。
1.2.7人工胃液和人工腸液耐受性試驗(yàn)
取培養(yǎng)24 h的菌懸液1 mL離心棄上清并加入生理鹽水重懸，向重懸后的菌懸液中分別加入1 mL經(jīng)濾膜過濾除菌的人工胃液和人工腸液，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)，取其在培養(yǎng)0和3 h時(shí)的菌懸液各100μL，對(duì)其梯度稀釋后涂布，用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù)，以0 h為對(duì)照，計(jì)算存活率，測(cè)定菌株在胃液中的耐受性。人工胃液和人工腸液配制方法參照2020版《中華人民共和國藥典》。存活率計(jì)算公式如下:
存活率(%)=100×lgNt/lgN0。
式中:N0為0 h活菌數(shù);Nt為3.0 h活菌數(shù)。
1.2.8膽鹽耐受性試驗(yàn)
將培養(yǎng)24 h的菌懸液以2.0%的接種量接種于膽鹽濃度分別為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)，取其在培養(yǎng)0、3、6 h時(shí)的菌懸液測(cè)定OD600值，每組設(shè)置3個(gè)平行。最終結(jié)果以平均值為標(biāo)準(zhǔn)繪制統(tǒng)計(jì)圖。
1.2.9抑菌試驗(yàn)
將培養(yǎng)24 h的菌懸液離心取上清液備用，活化大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌并制備菌懸液，分別取200μL均勻涂布于LB平板上，上清液通過牛津杯瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，測(cè)定抑菌圈。大于牛津杯直徑(8 mm)1 mm的抑菌圈直徑視為具有抑菌性，小于等于1 mm的抑菌圈直徑視為無抑菌性。
1.2.10耐藥性試驗(yàn)
取培養(yǎng)24 h的菌懸液200μL均勻涂布于MRS平板上，室溫放置3~5 min，利用紙片擴(kuò)散法將抗菌藥物紙片貼于已接種細(xì)菌的瓊脂表面，測(cè)定菌株對(duì)青霉素G、氯霉素、頭孢孟多、克林霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、慶大霉素、萬古霉素、磷霉素、阿奇霉素、甲氧芐啶和甲硝唑12種抗生素的耐藥性。大于藥敏片直徑(6 mm)1 mm的抑菌圈直徑視為具有抑菌性，小于等于1 mm的抑菌圈直徑視為無抑菌性。
1.2.11動(dòng)物安全性試驗(yàn)
將20只體重(22±2)g的昆明系雌性小鼠隨機(jī)分為2組，每組10只。將菌液濃度調(diào)整為1×109 CFU/mL備用，試驗(yàn)組小鼠每只一次性腹腔注射0.3 mL菌液，對(duì)照組小鼠腹腔注射等量的生理鹽水，留察7 d，記錄各組小鼠每日的體重變化、死亡情況，7 d后對(duì)每組小鼠進(jìn)行剖檢，對(duì)比2組間小鼠內(nèi)臟器官變化。
1.3數(shù)據(jù)分析
數(shù)據(jù)通過SPSS 26.0軟件中t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用Graph Pad Prism 8.0.1軟件作圖，P<0.05為差異顯著。
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