間充質(zhì)干細胞從骨髓、脂肪、子宮內(nèi)膜息肉、牙髓、外周血、胎盤、子宮內(nèi)膜、臍帶血、臍帶華通氏膠等組織中提取出，其致瘤性低，臨床應用相對安全。其中，臍帶華通氏膠具有來源易得、可在無創(chuàng)且無菌的條件下獲取、分離方法簡便、分離的間充質(zhì)干細胞數(shù)量多且增殖能力強等優(yōu)勢。并且，臍帶間充質(zhì)干細胞具有低免疫原性，不會引起宿主的免疫排斥；安全性良好，不具致瘤性；不存在倫理爭議。這些優(yōu)點均為后期的臨床應用及轉(zhuǎn)化提供了便利性與安全性的保障。
人臍帶間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUMSCs）因其來源廣泛、增殖能力強、免疫原性低等優(yōu)點，在臨床應用中備受關(guān)注。由于從機體組織分離得到的hUMSCs數(shù)量有限，而傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)所得的細胞數(shù)有限，且培養(yǎng)過程中因使用胎牛血清（FBS）而不符合臨床應用要求，故需建立臨床級人臍帶間充質(zhì)干細胞（hUMSCs）規(guī)?；瘮U增技術(shù)。此外，hUMSCs成骨分化能力低，限制了其在疾病治療中的應用，因此有必要增強hUMSCs成骨分化能力。
在人體中，骨骼系統(tǒng)將各種骨系統(tǒng)性的排列起來，為機體提供結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和保護器官的作用。膝關(guān)節(jié)作為一個負荷承載器，作用是使上肢保持穩(wěn)定，并幫助人完成各種日?；顒?，如行走、跑步、跳躍、玩耍等。膝關(guān)節(jié)位于髖關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)之間，是人體內(nèi)一種最大、最復雜的下肢關(guān)節(jié)。由三個突出的關(guān)節(jié)骨（股骨、脛骨和髕骨）組成，支持人體的幾乎所有活動和全部重量。
骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis,OA）是最常見的關(guān)節(jié)疾病，表現(xiàn)為局部退行性病變，可能主要發(fā)生在一個關(guān)節(jié)處或涉及多個關(guān)節(jié)病變。它較常發(fā)生在較大的承重關(guān)節(jié)如膝關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié)等部位，以及手和脊柱等小關(guān)節(jié)處。OA影響全球估計超過3億人，其中在美國估計有超過5000萬人，中國有2610萬人（1990年），后上升至6120萬人（2017年）。骨性關(guān)節(jié)炎影響了全球約10%的男性和18%的女性，其中女性骨關(guān)節(jié)炎患病率高于男性。膝關(guān)節(jié)處的骨性關(guān)節(jié)炎（Knee Osteo arthritis,KOA）是全球各種肌肉骨骼疾病中最常見的關(guān)節(jié)疾病，約占全球骨性關(guān)節(jié)炎總負擔的85%。
KOA的臨床特征是關(guān)節(jié)功能障礙、疼痛、僵硬、活動受限。其中最突出的是疼痛，僵硬在早上或長時間坐著后更嚴重，同時伴有不穩(wěn)定（關(guān)節(jié)屈曲或擺動）、抽搐和僵硬，導如步行、運動和舞蹈等活動能力喪失。疼痛在疾病發(fā)展過程的早期與關(guān)節(jié)使用有關(guān)，但隨著時間的推移可能變得難以預測。10%的KOA患者無法進行日常生活活動，甚至導致身體殘疾。就殘疾負擔而言，2015年骨關(guān)節(jié)炎占全球殘疾生活年限（Global Years of Living withDisability）的3.9%，到2020年，預計它將成為全球殘疾生活年限的第四大原因。另外，骨關(guān)節(jié)炎通常會引起并發(fā)癥，這可能是缺乏體力活動、藥物毒性和炎癥細胞因子的聯(lián)合作用。許多骨關(guān)節(jié)炎患者，特別是老年患者（65歲及以上），將會伴有一種或多種并發(fā)癥。
骨關(guān)節(jié)炎治療的基礎包括運動、適當?shù)捏w重減輕，以及對那些沒有禁忌癥的患者輔以局部或口服非甾體抗炎藥（NSAIDs）。其有效的非手術(shù)治療選擇有限。骨關(guān)節(jié)炎癥狀晚期和結(jié)構(gòu)損傷的患者只能進行關(guān)節(jié)置換術(shù)，且當前由OA引發(fā)的髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)置換術(shù)率增加，強調(diào)對有效非手術(shù)治療的迫切需要。
盡管基于MSCs的細胞療法有望用于疾病治療，但在將該細胞進行廣泛的臨床應用之前，仍存在諸多挑戰(zhàn)。由于MSCs在諸如骨髓、臍帶血、滑膜、牙髓、胎盤、臍帶等組織中的存在比例較低，因此對于許多臨床適應癥的治療應用，必須將MSCs分離并進行體外擴增。為滿足臨床應用要求，離體擴增的這一階段應在符合良好組織培養(yǎng)規(guī)范和良好生產(chǎn)規(guī)范（GMP）要求的培養(yǎng)條件下完成，在MSCs擴增過程中不引入異源成分，且在嚴格的封閉操作系統(tǒng)中進行，保證MSCs產(chǎn)品的安全性。但是，直到現(xiàn)在，胎牛血清（FBS）仍作為大多數(shù)細胞培養(yǎng)的補充劑，F(xiàn)BS中異源成分的存在使經(jīng)FBS培養(yǎng)的MSCs輸入人體內(nèi)可能引起機體免疫反應。
因此，在保證無異源物質(zhì)污染的基礎上，建立有效的MSCs體外擴增體系是一個亟待解決的問題。
現(xiàn)有技術(shù)中已有的干細胞的制備來源有限，且在干細胞的分離培養(yǎng)過程中涉及多種蛋白酶以及動物源性的培養(yǎng)材料的使用，這對后續(xù)制備獲得的干細胞制劑的進一步應用帶來了較大的障礙，存在制備的干細胞使用受限的不足。
針對現(xiàn)有技術(shù)中干細胞制備方法不足的問題，提供一種新的干細胞的制備方法。本文提供的P1代和P8代細胞均具有良好的生長曲線和增殖能力，說明采用上述方法制備的人臍帶間充質(zhì)干細胞具備較強的自我更新和繁殖能力。
將制備獲得的人臍帶間充質(zhì)干細胞應用于治療膝骨關(guān)節(jié)炎的小鼠，可以顯著抑制小鼠骨贅形成，能顯著促進關(guān)節(jié)間隙擴大，抑制硬化骨產(chǎn)生，有效的減輕骨質(zhì)增生的作用，并且加快軟骨分層，促進軟骨生長增加，有利于膝骨關(guān)節(jié)炎的治療和改善。
臍帶間充質(zhì)干細胞的制備方法及步驟：
1）取新鮮臍帶，分離獲得華通氏膠并置于細胞裂解液中浸泡；
2）處理后的華通氏膠用生理鹽水洗滌，置于培養(yǎng)皿中，CO2
細胞培養(yǎng)箱放置2h后，向組織塊中加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；
3）每隔7天左右，觀察細胞并進行換液補液，當細胞融合度達到85%以上時，將貼壁的臍帶組織重新平鋪于新的培養(yǎng)皿，進行二次組織貼壁培養(yǎng)；
4）加入含有胰蛋白酶替換物的PBS處理細胞團，待細胞分散后，離心后采用完全培養(yǎng)基重懸，獲得第一代hMSCs。
臍帶間充質(zhì)干細胞增殖性實驗
將P5和P8代人臍帶間充質(zhì)干細胞以104個細胞/孔的密度分別接種6塊96孔板，從細胞接種到96孔板后的24 h開始，采用CCK-8法測定，測量7天，取6塊培養(yǎng)板的測定平均值繪制出生長曲線。測定結(jié)果參見下表1，對應的生長曲線圖參見圖1。
表1：P5和P8代人臍帶間充質(zhì)干細胞的生長曲線測定數(shù)值
圖1P5和P8代人臍帶間充質(zhì)干細胞生長曲線圖
從測定結(jié)果來看，P5和P8代人臍帶間充質(zhì)干細胞在前4天均呈現(xiàn)明顯的對數(shù)生長，其中第四天的細胞密度約為第一天的4倍，后期，由于空間和營養(yǎng)的限制，細胞不再快速增殖，進入滯長期，此外，P5和P8代細胞的生長曲線呈現(xiàn)高度擬合，且每天的吸光度數(shù)值之間沒有統(tǒng)計學差異，說明所檢測的P5和P8代人臍帶間充質(zhì)干細胞能夠在體外保持增殖活力并且具有相似的增殖能力與生長規(guī)律，進一步表明，采用本方法制備的人臍帶間充質(zhì)干細胞，不同代之間，生長規(guī)律近似，性質(zhì)穩(wěn)定，具備良好的增殖規(guī)律以及增殖速度。
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