1、材料與方法
1.1菌株來(lái)源及培養(yǎng)條件
實(shí)驗(yàn)所用的食源性致病菌菌株[原始數(shù)據(jù)存儲(chǔ)在國(guó)家微生物科學(xué)數(shù)據(jù)中心，編號(hào)為NMDCX0002088]購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，其余菌株則保藏于寧波大學(xué)海洋生物病毒研究室菌種庫(kù)。LB半固體培養(yǎng)基：瓊脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75%的LB培養(yǎng)基；LB固體培養(yǎng)基：瓊脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的LB培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件：37℃、150 r/min。
1.2噬菌體的分離純化
于浙江省寧波市北侖區(qū)路林市場(chǎng)(29.906 300°N，121.605 903°E)下水道采集表層水樣(2023年04月25日)，低溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室后在4℃、8 000×g離心10 min，取上清依次經(jīng)0.45μm和0.22μm孔徑的聚醚砜濾膜過(guò)濾。取CICC 10869用LB肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(OD600≈0.6)。為了富集噬菌體，將40 mL對(duì)數(shù)期菌液、40 mL上述水樣濾液和40 mL 3×LB液體培養(yǎng)基于錐形瓶中混合，37℃、150 r/min培養(yǎng)3 h；同期將40 mL對(duì)數(shù)期菌液、40 mL純水和40 mL 3×LB的混合液作為對(duì)照組培養(yǎng)。將實(shí)驗(yàn)組裂解澄清的培養(yǎng)液在4℃、8 000×g離心10 min，取上清液依次經(jīng)0.45μm和0.22μm孔徑的聚醚砜濾膜過(guò)濾，得到的過(guò)濾液即為噬菌體富集液。
采用雙層瓊脂平板法進(jìn)行噬菌體純化，3代后獲得形態(tài)、大小均一的噬菌斑。挖取單個(gè)噬菌斑至5 mL新鮮培養(yǎng)的CICC 10869菌液中，37℃、150 r/min培養(yǎng)至裂解澄清，同期設(shè)置未加噬菌斑的菌液作為對(duì)照組。
Yen-yong1在菌苔上形成的透明噬菌斑周圍具有半透明暈圈(halo)。噬菌體透明噬菌斑周圍的半透明暈圈是由于暈圈所在位置的細(xì)菌在未被噬菌體感染時(shí)，其胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)被噬菌體的自由擴(kuò)散的解聚酶降解造成的。噬菌斑周圍是否具有半透明暈圈被認(rèn)為是判斷噬菌體是否具有解聚酶(depolymerase)的最直觀方法。解聚酶通常具有高耐熱性，而噬菌體通常不耐高溫，可以基于如下原理進(jìn)行解聚酶活性驗(yàn)證：將噬菌體懸液高溫(如70℃)處理以滅活噬菌體后，點(diǎn)至菌平板上孵育，如噬菌體有解聚酶則會(huì)在菌苔上相應(yīng)區(qū)域形成半透明的暈圈。因此，進(jìn)一步檢測(cè)Yen-yong1的解聚酶活性：將噬菌體Yen-yong1懸液在70℃下孵育30 min使Yen-yong1滅活，然后滴至CICC 10869瓊脂平板上(2.5μL/點(diǎn))進(jìn)行點(diǎn)斑實(shí)驗(yàn)，觀察是否在菌苔上形成半透明暈圈。
1.3噬菌體的形態(tài)學(xué)觀察
取新鮮培養(yǎng)的噬菌體-菌裂解液滴至銅網(wǎng)(200目)上，靜置10 min后用中性濾紙吸去多余水分，用2%乙酸鈾酰負(fù)染色30 s，用中性濾紙吸去多余染色劑，靜置10 min后在透射電鏡(Hitachi公司)下觀察噬菌體形態(tài)。
1.4噬菌體的基因組提取與測(cè)序
進(jìn)行噬菌體的基因組提取、測(cè)序與拼接。取噬菌體-菌裂解液離心、過(guò)濾后，取上清液濾液，加入DNase I和RNase A酶解污染的宿主核酸后，采用經(jīng)典的酚/氯仿法提取噬菌體DNA，用NEBNext UltraⅡDNA Library Prep Kit for Illumina(New England Biolabs,NEB公司)按照說(shuō)明書構(gòu)建基因組文庫(kù)。使用Illumina PE300試劑盒，在Illumina MiSeq上進(jìn)行測(cè)序，用Trimmomatic v0.36軟件去除低質(zhì)量值的測(cè)序reads(Q-value<20)，使用SPAdes v3.13.0軟件對(duì)過(guò)濾后的數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接。
1.5噬菌體基因組注釋
使用童貽剛教授團(tuán)隊(duì)研發(fā)的方法和軟件PhageTerm對(duì)噬菌體基因組的末端進(jìn)行分析。
使用在線工具RAST對(duì)噬菌體Yen-yong1的基因組進(jìn)行初步的開放閱讀框(open reading frames,ORFs)預(yù)測(cè)與注釋。在此基礎(chǔ)上，使用BLASTp、HHpred和HMMER對(duì)預(yù)測(cè)的所有ORFs進(jìn)行驗(yàn)證和校準(zhǔn)。使用PerL語(yǔ)言腳本構(gòu)建噬菌體的基因圖譜(genome map)，并用Inkscape作圖軟件對(duì)矢量圖進(jìn)行美化。
使用在線工具tRNAscan-SE對(duì)噬菌體基因組中的tRNA進(jìn)行在線預(yù)測(cè)。
使用VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)噬菌體基因組中是否含有毒力因子基因。
用CARD數(shù)據(jù)庫(kù)分析噬菌體基因組中是否含有耐藥基因。
1.6噬菌體系統(tǒng)進(jìn)化地位分析
使用NCBI提供的BLASTn搜索與Yen-yong1基因組同源的序列，所選數(shù)據(jù)庫(kù)為nucleotide collection。
使用PASC計(jì)算公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有病毒與Yen-yong1基因組間的成對(duì)核苷酸序列相似度值(PASC值)。
使用在線工具ViPTree，基于tBLASTx計(jì)算的全基因組序列相似性，以公共數(shù)據(jù)庫(kù)中所有病毒基因組(共7 002株)作為參考序列與Yen-yong1一同構(gòu)建總蛋白譜系統(tǒng)進(jìn)化樹(proteomic tree)。在此基礎(chǔ)上，選取在總進(jìn)化樹中與Yen-yong1進(jìn)化距離最近的3株病毒(Escherichia phage HK639、Cronobacter phage phiES15、Aeromonas phage pAEv1818)、在BLASTn和PASC比對(duì)中與Yen-yong1相似性最高的病毒、在國(guó)際病毒分類委員會(huì)(ICTV)分類系統(tǒng)中各單元中的代表性噬菌體以及在ICTV中有分類地位的11株小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌噬菌體的基因組作為參考序列，構(gòu)建精細(xì)蛋白譜系統(tǒng)進(jìn)化樹。用Inkscape作圖軟件對(duì)矢量圖進(jìn)行美化。
使用在線工具EzBioCloud中的ANI Calculator工具計(jì)算Yen-yong1和在進(jìn)化樹中與之進(jìn)化距離最近的3株病毒之間的平均核苷酸一致性(average nucleotide identity,ANI)。使用在線工具Genome-to-Genome Distance Calculator計(jì)算Yen-yong1和在進(jìn)化樹中與之進(jìn)化距離最近的3株病毒之間的DNA分子原位雜交值(in silico DNA-DNA hybridization,isDDH)。使用在線工具The virus intergenomic distance calculator計(jì)算Yen-yong1與進(jìn)化樹中進(jìn)化距離最近的3株病毒的基因組間的成對(duì)基因組間相似性(VIRIDIC值)。
用Easyfig軟件[30]構(gòu)建Yen-yong1和與之親緣關(guān)系最近的噬菌體之間的基因組相似性比較圖。
使用在線工具VirClust分析Yen-yong1與近源噬菌體間共享的核心基因(core gene)。
1.7宿主范圍和成斑率(efficiency of plating,EOP)測(cè)定
采用點(diǎn)斑法檢測(cè)Yen-yong1的宿主范圍，供試菌共65株(編號(hào)為NMDCX0002088)。分別將200μL對(duì)數(shù)期菌液(2.38×107 CFU/mL)與4 mL LB半固體培養(yǎng)基混勻，傾倒在LB固體培養(yǎng)基上，制成雙層瓊脂平板。凝固后，在平板上等間隔滴加噬菌體懸液(2.5μL/點(diǎn)，1.95×109 PFU/mL)。將培養(yǎng)皿倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。若試驗(yàn)平板上出現(xiàn)明顯的透明噬菌斑，則認(rèn)為噬菌體裂解該菌株，為陽(yáng)性結(jié)果；反之則認(rèn)為噬菌體不能裂解該菌株，為陰性結(jié)果。每個(gè)菌株重復(fù)3次點(diǎn)斑實(shí)驗(yàn)。參照文獻(xiàn)[32]，采用雙層瓊脂平板法測(cè)定Yen-yong1(1.95×109 PFU/mL)在各個(gè)宿主菌株菌苔上出現(xiàn)的噬菌斑數(shù)，以在指示菌株CICC 10869菌苔上出現(xiàn)的平均噬菌斑數(shù)為分母，以其他易感菌菌苔上的噬菌斑數(shù)為分子，計(jì)算Yen-yong1在其他易感菌的成斑率。EOP實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.8噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線
參照文獻(xiàn)[33-34]測(cè)定Yen-yong1對(duì)指示菌CICC 10869的最佳感染復(fù)數(shù)(optimal multiplicity of infection,MOI)和最佳吸附時(shí)間。
取新鮮培養(yǎng)的CICC 10869對(duì)數(shù)期菌液(OD600≈0.6)與Yen-yong1按最佳MOI(MOI=1)混合，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中按照最佳吸附時(shí)間孵育6 min。將混合物4℃、8 000×g離心10 min，用LB液體培養(yǎng)基洗滌2次后，將沉積物重懸于等體積的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min培養(yǎng)，分別于0、10、20、30、40、50、60、90、120、150、180、210、240 min取樣。采用雙層瓊脂平板法檢測(cè)樣品中噬菌體滴度。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。參照文獻(xiàn)[35]計(jì)算噬菌體的暴發(fā)量(burst size)，如公式(1)所示。
暴發(fā)量(PFU/cell)=暴發(fā)期結(jié)束時(shí)游離的噬菌體數(shù)/潛伏期開始時(shí)感染的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)(1)
1.9噬菌體的理化穩(wěn)定性
1.9.1酸堿敏感性檢測(cè)
取Yen-yong1懸液(2.00×109 PFU/mL)分裝成1 mL/管，用NaOH或HCl分別將其調(diào)至pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0，于37℃孵育2 h后取樣。
1.9.2鹽度敏感性檢測(cè)
分別配制NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、1%、3%、5%、7%和9%的LB固體培養(yǎng)基和LB半固體培養(yǎng)基。分別取4 mL各鹽濃度的半固體LB培養(yǎng)基與100μL Yen-yong1懸液(4.47×108 PFU/mL)、200μL對(duì)數(shù)期CICC 10869(2.23×107 CFU/mL)菌液充分混合后，立即傾倒至相應(yīng)鹽濃度的LB固體培養(yǎng)基上，冷卻后倒置于培養(yǎng)箱(37℃)中培養(yǎng)12 h后進(jìn)行噬菌斑計(jì)數(shù)，計(jì)算噬菌體滴度。
1.9.3溫度敏感性檢測(cè)
取Yen-yong1懸液(3.70×109 PFU/mL)分裝成1 mL/管，分別置于-80、0、25、40、50、60、70和80℃孵育，分別于0、30、60、90和120 min取樣。
1.9.4噬菌體長(zhǎng)期保存條件檢測(cè)
取新鮮培養(yǎng)的充分裂解的噬菌體-菌裂解液(2.63×109 PFU/mL)分裝成1 mL/管，分別于-80、-20、25(室溫)和4℃存放，用于檢測(cè)溫度對(duì)噬菌體活性的影響。在0-360 d中每隔30 d取樣檢測(cè)噬菌體滴度，每次每樣取3個(gè)平行管。在該種操作下，每個(gè)存于-80℃和-20℃的樣品均只凍融1次。
為了檢測(cè)多次凍融是否影響噬菌體滴度，取新鮮培養(yǎng)的充分裂解的噬菌體-菌裂解液(2.63×109 PFU/mL)裝于50 mL無(wú)菌EP離心管中(40 mL/管)，分別存放于-80℃和-20℃，用于檢測(cè)在該溫度下凍存次數(shù)對(duì)噬菌體活性的影響。在0-360 d中每隔30 d化凍、取樣檢測(cè)噬菌體滴度，每次每樣取3個(gè)平行管。
采用雙層瓊脂平板法測(cè)定樣品的噬菌體滴度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.10噬菌體對(duì)細(xì)菌生物被膜的清除能力
1.10.1細(xì)菌生物被膜形成能力檢測(cè)
采用結(jié)晶紫染色法[36]測(cè)定易感細(xì)菌的生物被膜形成能力。分別將易感菌株接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min培養(yǎng)16 h。取100μL培養(yǎng)液加入到10 mL LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行稀釋。實(shí)驗(yàn)組分別取500μL稀釋菌液加入到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，對(duì)照組則加入500μL LB液體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h。然后用槍頭吸去培養(yǎng)孔中的液體，用0.01 mol/L PBS洗滌培養(yǎng)孔3次。在每個(gè)培養(yǎng)孔中加入500μL甲醇固定30 min，棄去甲醇并在室溫下干燥；在每個(gè)培養(yǎng)孔中加入500μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的結(jié)晶紫于室溫下對(duì)生物被膜染色30 min，用無(wú)菌水(ddH2O)洗滌培養(yǎng)孔3次，在室溫下干燥。隨后向每孔加入500μL體積分?jǐn)?shù)為33%的冰醋酸。使用酶標(biāo)儀測(cè)定OD590值。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
細(xì)菌生物被膜形成能力判定標(biāo)準(zhǔn)分為強(qiáng)(4×ODc≤ODt)、中等(2×ODc<ODt≤4×ODc)、弱(ODc<ODt≤2×ODc)和無(wú)生物被膜形成(ODt≤ODc)這4個(gè)水平。其中，ODc和ODt分別為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的OD590值。
1.10.2噬菌體對(duì)細(xì)菌生物被膜的清除能力
參照文獻(xiàn)[36]測(cè)定噬菌體對(duì)細(xì)菌生物被膜的清除能力。按照細(xì)菌生物被膜形成能力檢測(cè)方法(1.10.1節(jié))培養(yǎng)各易感細(xì)菌的生物被膜，實(shí)驗(yàn)組每孔加入500μL噬菌體Yen-yong1懸液(1.85×109 PFU/mL)，對(duì)照組加入等體積的LB，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。然后按照1.10.1節(jié)的步驟進(jìn)行結(jié)晶紫染色和OD590測(cè)定。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.11噬菌體對(duì)生豬肉中病原菌的控制
為檢測(cè)Yen-yong1對(duì)生豬肉中污染的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的去除效果，分別在25℃和4℃下進(jìn)行了細(xì)菌清除實(shí)驗(yàn)。
從市場(chǎng)購(gòu)買新鮮生豬肉500 g，用75%乙醇浸泡1 min以消毒表面。在超凈工作臺(tái)中取出并晾干后，用無(wú)菌解剖刀切除表層，切成大小均一的肉片(1 cm×1 cm×0.5 cm)，置于帶蓋無(wú)菌培養(yǎng)皿中。取新鮮培養(yǎng)的對(duì)數(shù)期小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌菌液，均勻滴加于生豬肉片表面(20μL/片，2×107 CFU/mL)，隨機(jī)將其分成兩組。實(shí)驗(yàn)組分別按照不同MOI(MOI=1、10、100)均勻滴加噬菌體Yen-yong1懸液(20μL/片，2×107、2×108、2×109 PFU/mL)，對(duì)照組均勻滴加20μL LB液體培養(yǎng)基。再次將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均分為兩組，分別置于室溫(25℃)和冷藏室(4℃)，以模擬豬肉在市場(chǎng)銷售和貯運(yùn)的條件。對(duì)室溫放置的豬肉片分別于0 h和3 h取樣；對(duì)冷藏的豬肉片分別于0 h和24 h取樣。由于屠宰的生豬通常為冷藏運(yùn)輸、儲(chǔ)存和出售，只有部分菜場(chǎng)會(huì)將少量豬肉置于常溫短期擺放，因此4℃下的實(shí)驗(yàn)取樣時(shí)長(zhǎng)為24 h，而25℃下為3 h。將取得的肉片樣品分別置于無(wú)菌EP管中，加入1 mL LB液體培養(yǎng)基，研磨后采用標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)菌數(shù)量。每組設(shè)置3個(gè)平行。細(xì)菌清除率計(jì)算如公式(2)所示。
細(xì)菌清除率=(對(duì)照組小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌平均濃度-實(shí)驗(yàn)組小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌平均濃度)/(對(duì)照組小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌平均濃度)×100%(2)
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