據(jù)WHO估計，全球約有1/3的人口是結(jié)核分枝桿菌潛伏感染患者，其中有5%～10%的人會發(fā)展成活動性肺結(jié)核。潛伏期結(jié)核分枝桿菌存在于肉芽腫組織中，這是一種低氧、高一氧化氮、營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的微環(huán)境。結(jié)核分枝桿菌在此環(huán)境中處于休眠期，生長速度非常緩慢，也正是因為如此，結(jié)核分枝桿菌逃避了機體免疫系統(tǒng)的作用，從而存活下來。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌基因組存在著一組包含48個基因的休眠存活調(diào)節(jié)子(DosR),這48個基因編碼的蛋白控制著結(jié)核潛伏期的生理過程。肉芽腫組織中的結(jié)核分枝桿菌存在著依賴氧壓的細胞和生化動力學機制，能夠使其快速適應微環(huán)境改變的能力，在此過程中結(jié)核分枝桿菌DsoR基因起著至關(guān)重要的作用。與活動期結(jié)核分枝桿菌相比，DosR區(qū)域編碼的抗原能夠引起潛伏期結(jié)核患者產(chǎn)生更強烈的免疫反應，這表明DosR基因很可能在潛伏期特異性表達。有研究報道，DosR基因編碼的許多蛋白有助于結(jié)核分枝桿菌利用其他碳源途徑獲得能量，如乙醛酸代謝、硝基還原和脂肪酸代謝等。探索DosR基因生物學功能有助于進一步認識結(jié)核分枝桿菌潛伏期的生理調(diào)控過程，從而有針對性地進行檢測，實現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的目的，對于預防活動性結(jié)核的發(fā)生至關(guān)重要。
1材料與方法
1.1儀器與試劑本實驗試劑結(jié)核分枝桿菌H37Rv株，載體pET30a由本實驗室保存。大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞購自南京諾唯贊公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天恩澤公司；膠回收試劑盒購自Zymo公司；各種限制性內(nèi)切酶購自Thermo公司；DNA聚合酶和連接酶購自TaKaRa公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)購自Sigma公司。美國Biorad酶標儀。
1.2方法
1.2.1結(jié)核分枝桿菌DNA的提取
結(jié)核分枝桿菌DNA的提取依據(jù)已報道的文獻進行。具體方法如下：挑取結(jié)核分枝桿菌菌落，置于裝有200μL生理鹽水的1.5 mL離心管中，80℃煮沸滅活30 min，12 000 r/min離心15 min后，加入蛋白酶K和溶菌酶充分裂解結(jié)核分枝桿菌，然后用酚-氯仿抽提法獲取結(jié)核分枝桿菌基因組，無水乙醇沉淀雙鏈DNA，干燥后TE緩沖液(50μL)溶解DNA。
1.2.2引物設計
在DBGET數(shù)據(jù)庫中查找結(jié)核基因Rv2029c的全基因序列，然后采用Primer5.0和Oligo6.0設計Rv2029c特異性引物序列，上下游分別插入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點。設計的引物序列為上游引物Rv2029F：CGG AAT CCA TGA CGG AGC CAG CGG CGT，其中CG是保護性堿基，GAA TCC是EcoRⅠ酶切位點；下游引物Rv2029R：CCC AAG CTT TCA TGG CGA GGC TTC CGG GTT，其中CCC是保護性堿基，AAGCTT是HindⅢ酶切位點。
1.2.3純化目的
基因采用聚合酶鏈式反應(PCR)的方法對目的基因進行擴增，擴增條件：98℃變性10 s，55℃退火5 s，72℃延伸80 s，共擴增35個循環(huán)。擴增后的目的基因利用膠回收試劑盒(美國Zymo公司膠回收試劑盒，D4007)進行純化和濃縮。具體方法如下：首先在瓊脂糖凝膠上準確切取目的基因片段，然后加入凝膠溶解液，37～55℃孵育融化5～10 min后，過柱離心吸附，加Washing buffer洗滌2次后，用10～20μLTE緩沖液洗脫即可。
1.2.4重組質(zhì)粒的構(gòu)建重組
質(zhì)粒PE730a-Rv2029c的構(gòu)建依據(jù)文獻，主要概述如下：用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ對目的基因和載體pET30a進行雙酶切，然后經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收。目的基因和載體按3∶1的比例，在DNA連接酶的作用下，16℃過夜連接。連接后的目的基因，導入到大腸埃希菌感受態(tài)(BL21)細胞中，4℃水浴30 min后，42℃準確熱激45 s后，加入無抗菌藥物的LB培養(yǎng)液后，細菌復蘇45 min，然后將細菌均勻涂到含卡那霉素(50μg/mL)的LB固體培養(yǎng)皿中，37℃過夜后挑取陽性單克隆菌落并提取質(zhì)粒(北京天恩澤公司質(zhì)粒提取試劑盒，60205)，雙酶切(EcoRⅠ和HindⅢ)鑒定后送南京金斯瑞公司進行測序分析。
1.2.5重組質(zhì)粒pET30a-Rv2029c促生長作用
研究大腸埃希菌BL21是一種常用的基因工程表達菌株，其生長分為遲緩期、對數(shù)期、平臺期和衰亡期。遲緩期大腸埃希菌適應新的環(huán)境，因此生長速度很慢，對數(shù)期營養(yǎng)物質(zhì)充分，細菌呈對數(shù)增長，隨著培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，大腸埃希菌代謝產(chǎn)物不斷積累，培養(yǎng)基pH逐漸下降，大腸埃希菌生長速度變慢，細菌總數(shù)趨于穩(wěn)定。大腸埃希菌的平臺期與結(jié)核分枝桿菌的肉芽腫微環(huán)境相似，對細菌的生長都是一種不利的環(huán)境，以此模擬肉芽腫微環(huán)境，將結(jié)核DosR蛋白導入大腸埃希菌BL21中，觀察對其生長有無影響。
取出保存的pET30a大腸埃希菌(空質(zhì)粒組)和pET30a-Rv2029c大腸埃希菌(重組質(zhì)粒組)，在含50μg/mL卡那霉素的5 mL LB培養(yǎng)液中37℃振蕩培養(yǎng)過夜，記錄吸光度(OD)600值。然后將菌液調(diào)整至相同的OD值并吸取600μL菌液加至300 mL LB培養(yǎng)基中(含50μg/mL卡那霉素)，37℃300 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔1 h取600μL菌液，檢測OD值(每次測3組OD值，每組測200μL)。在第5個小時當2組大腸埃希菌OD值為0.45時，加入誘導劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(500 mmol/L),之后繼續(xù)每隔1 h取600μL菌液測OD值，如此連續(xù)重復測量15 h。在相同條件(相同菌種，相同生長和測量條件)下重復該實驗3次。
1.3統(tǒng)計學處理
采用SPSS22.0對1.6實驗結(jié)果進行定量數(shù)據(jù)重復測量的方差分析及t檢驗，比較空質(zhì)粒組與重組質(zhì)粒組對大腸埃希菌OD值是否產(chǎn)生影響，并作出生長曲線圖。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
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