摘要：【目的】篩選并分離出能裂解腸侵襲性大腸埃希菌噬菌體，分析其生物學(xué)特性，并探究其對污染豬肉的殺菌作用。【方法】采用雙層平板法分離鑒定噬菌體，并測定其最佳感染復(fù)數(shù)，一步生長曲線等，對其基因組進行測序分析以及裂解功效的測定?！窘Y(jié)果】從醫(yī)院污水中分離鑒定能特異裂解腸侵襲性大腸埃希菌（Enteroinvasive Escherichia coli coli，EIEC）的噬菌體并命名為DK-13，其呈典型的蝌蚪狀外形，包含一個正二十面體的頭部和一個可收縮的螺旋對稱的尾部，屬于肌尾噬菌體科（Myoviridae）噬菌體；生物學(xué)特性表明：最佳感染復(fù)數(shù)為0.01，潛伏期約為10 min，裂解期約為70 min，噬菌體DK-13能在50℃，pH 5.0-10.0條件下存活。全基因組測序表明，噬菌體基因組長約172 275 bp，GC含量為40.18%，預(yù)測其共有293個開放閱讀框（open reading frames,ORF）,未發(fā)現(xiàn)已知耐藥基因和毒力基因。應(yīng)用試驗表明：被污染的豬肉中表現(xiàn)的殺菌效果良好，宿主菌的數(shù)量明顯減少?！窘Y(jié)論】分離并鑒定一株新的烈性噬菌體DK-13，DK-13具有潛伏期短、裂解效率高等優(yōu)勢，在食品安全方面具有很大應(yīng)用潛力。
大腸埃希菌（Escherichia coli,E.coli）屬于革蘭氏陰性桿菌，廣泛存在于自然界中，絕大多數(shù)屬于正常菌群，但其在具有某些特定毒力因子時具有致病性，能引起人和動物共同感染。且可通過污染被屠宰動物或其他動物源性食品等途徑從食物鏈感染人體，可引起腹部絞痛，帶血和黏液的腹瀉等癥狀。抗生素一直是抗菌的重要手段之一，但由于抗生素的濫用，耐藥菌株的大量出現(xiàn)，導(dǎo)致了未來沒有針對耐藥菌的藥物可用的情況。因此迫切需要開發(fā)具有替代作用的新的抗菌策略。
噬菌體在自然界中種類繁多，具有高度多樣化，基本感染現(xiàn)存的所有細菌。其基因組編碼的蛋白質(zhì)可用于食品安全防治、耐藥菌株引起的感染治療等。噬菌體還被發(fā)現(xiàn)在對養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的牲畜的殺菌方面有較好的效果，從而限制病原體進入食物鏈的風(fēng)險，還可用于檢測動物源性食品中的病原體。例如，噬菌體產(chǎn)品SalmoFreshTM和EcoShiledTM已被開發(fā)并批準(zhǔn)用于食品工業(yè)，以抑制食源性微生物。噬菌體裂解細菌的功效已經(jīng)在各種研究中得到證實，使用噬菌體成為用于食品安全防治的有效方法。由于多數(shù)噬菌體裂解宿主菌的專一性，需篩選并分離新的噬菌體以擴增噬菌體庫以增加宿主范圍，為未來雞尾酒噬菌體制劑應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。
本研究分離得到一株特異性較強的能裂解腸侵襲性大腸埃希菌的噬菌體，是一種潛伏期短、裂解效率高、耐高溫以及耐酸堿的烈性噬菌體，具有應(yīng)用于食品安全防治的潛力，為以后解決食品污染問題提供了一種新的解決策略。另外本研究還進行全基因組測序并分析預(yù)測了裂解宿主菌的相關(guān)基因，為進一步研究噬菌體應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株和污水樣品
宿主菌腸侵襲性大腸埃希菌D1從污染肉制品分離，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系保存，經(jīng)PCR鑒定為腸侵襲性大腸埃希菌，實驗所用其他大腸埃希菌，蠟樣芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌均由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系保存。
污水樣品采集于吉林大學(xué)第一醫(yī)院污水處理中心。
1.1.2培養(yǎng)基、主要試劑和儀器
營養(yǎng)瓊脂（NA）、營養(yǎng)肉湯（NB）、改良克氏雙糖鐵培養(yǎng)基管，青島高科園海博技術(shù)有限公司；聚乙二醇（PEG8000），Beijing Biotopped Science；DNaseI酶，RNaseA酶，大連TaKaRa公司；SM緩沖液，武漢卡諾斯科技有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA）、Tris堿,北京康為世紀生物科技有限公司；無水乙醇、冰醋酸，天津市化學(xué)試劑有限公司；硫酸，錦州古城化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉，湖北鑫潤德化工有限公司。
1.2方法
1.2.1宿主菌的分離與鑒定
吸取20μL EIEC凍干粉溶解液加入10 mL NB中，37℃，160 r/min培養(yǎng)5 h后，用無菌接種環(huán)蘸取菌液進行分區(qū)劃線，過夜37℃培養(yǎng)，第2天觀察形態(tài)，挑取單菌落加入NB中培養(yǎng)后保存。挑取EIEC單菌落進行PCR確認試驗以鑒定。
1.2.2裂解性噬菌體的初步篩選
將未經(jīng)處理的醫(yī)院污水取出300 mL加入1.8 g固體CaCl2（0.6%）靜置30 min，5 000 r/min離心10 min，取100 mL的污水上清液和100 mL NB，并與5 mL EIEC的新鮮菌液混合，37℃培養(yǎng)過夜。次日5 000 r/min離心3 min，經(jīng)0.45μm濾器過濾后得到噬菌體初提液。取500μL EIEC菌液加入試管中，再加入5 mL半固體培養(yǎng)基（50℃左右），凝固后在表面中心處滴加2-3滴噬菌體初提液，晾干后倒置放入培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)過夜。次日觀察平板中心是否出現(xiàn)噬菌斑。
1.2.3噬菌體的分離純化及測定滴度
挑出形態(tài)最好的噬菌斑加入宿主菌液中培養(yǎng)8 h，5 000 r/min離心3 min，所得上清液用0.45μm濾器過濾，得到噬菌體純化液。取100μL噬菌體液倍比稀釋液與100μL宿主菌液混合于試管中，再加入5 mL半固體培養(yǎng)基（50℃左右），混勻后倒在瓊脂平板上，凝固后37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日觀察平板上的噬菌斑形態(tài)，挑取單個噬菌斑重復(fù)上述操作7-10次，最終得到純化后的純種噬菌體。
將純化后的噬菌體液進行倍比稀釋，重復(fù)一次純化的步驟，37℃恒溫培養(yǎng)過夜后，次日觀察并記錄各稀釋梯度平板上噬菌斑的數(shù)量，依據(jù)公式算出噬菌體的滴度。
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