1.1.2主要試驗用品
MRS肉湯培養(yǎng)基、胰蛋白大豆瓊脂(tryptic soy agar,TSA)培養(yǎng)基、瓊脂粉(agar powder)、過氧化氫酶(CAT,400 000 U/g)購自北京索萊寶有限責(zé)任公司,胰蛋白大豆肉湯(tryptic soy broth,TSB)培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司,乳酸鏈球菌素(Nisin,900 IU/mg)購自北京酷來搏科技有限公司,MRA瓊脂培養(yǎng)基是在MRS肉湯培養(yǎng)基中添加1.5%的瓊脂粉經(jīng)120℃高壓滅菌20 min后制成。
1.1.3主要儀器設(shè)備
Bioscreen全自動生長曲線分析儀,;凍干機(jī)(型號FDU-1200)。
1.2試驗方法
1.2.1乳酸菌的分離與純化
對從牛場采集的牛糞和羊瘤胃內(nèi)容物以及青貯飼料樣品進(jìn)行乳酸菌菌株分離。首先對牛糞樣品采用TSB培養(yǎng)基進(jìn)行富集,然后在TSA平板上進(jìn)行劃線分離,在37℃進(jìn)行培養(yǎng),直至長出單克隆,反復(fù)純化3次,得到18株細(xì)菌(F3-1①、F3-1②、F3-2①、F3-2②、F3-3①、F3-3②、F3-5①、F3-5②、F4-1①、F4-1②、F4-2①、F4-2②、F4-3①、F4-3②、F4-5①、F4-5②、F4-2③、F4-2④)。將羊瘤胃內(nèi)容物樣品用MRS肉湯培養(yǎng)基富集后,首先在MRS瓊脂培養(yǎng)基的平板上劃線分離,在含5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng),直至長出單克隆后用接種環(huán)無菌挑取白色黏液樣單克隆接種到3 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中,繼續(xù)在含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h以上;如此重復(fù)3次,直至劃線出形態(tài)相似,均一大小,邊緣整齊不透明,具有白色黏液樣的單克隆,做革蘭氏鏡檢,得到9株疑似乳酸菌(N1-1①、N1-1②、N2-1①、N3-1①、N4-1①、N4-1②、N5-1①、N5-1②、N7-1①)。按照羊瘤胃內(nèi)容物菌株分離方法處理青貯飼料樣品,分離得到2株細(xì)菌(S1-1①、S2-1①)。對上述29株分離細(xì)菌分別擴(kuò)增16S rDNA,由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。
1.2.2 16S rDNA測序鑒定
PCR擴(kuò)增體系:5.0μL 10×PCR Buffer,1μL正向引物27F,1μL反向引物1492R,2μL模板基因組DNA,0.5μL 5 U/μL Pfu DNA聚合酶,加ddH2O至50μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,48℃退火30 s,72℃延伸1 min 30 s,72℃延伸10 min,擴(kuò)增34個循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。
1.2.3乳酸菌生長特性及產(chǎn)酸能力測定
乳酸菌生長特性及產(chǎn)酸能力測定。對分離純化并經(jīng)16S rDNA測序的疑似乳酸菌的4株分離菌N3-1①、N4-1①、N5-1①、N7-1①活化后按照995μL MRS肉湯培養(yǎng)液加5μL菌液的接種量接種,37℃恒溫培養(yǎng)36 h,每個樣品制備3管,以空白培養(yǎng)基為對照,通過實時微生物生長分析系統(tǒng)連續(xù)測定600 nm波長下的吸光度(OD600 nm)值,同時測定菌液在培養(yǎng)0、2、4、6、8、12、24、36 h時的pH,以菌液培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo),OD600 nm值和pH為縱坐標(biāo)分別繪制生長曲線和產(chǎn)酸曲線。同時對上述菌株進(jìn)行革蘭氏染色和過氧化氫酶接觸試驗。
1.2.4 Nisin效價標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
準(zhǔn)確稱取1.00 g的Nisin標(biāo)準(zhǔn)品,溶于1 mL滅菌蒸餾水中,配成1 000 mg/mL的母液。再用滅菌蒸餾水稀釋成500、250、100、50、25 mg/mL的Nisin標(biāo)準(zhǔn)液。采取牛津杯雙層瓊脂平板法測定稀釋后的各濃度Nisin標(biāo)準(zhǔn)液對金黃色葡萄球菌ATCC29213株的抑菌圈直徑,以抑菌圈直徑為縱坐標(biāo),以Nisin濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.2.5乳酸菌抑菌試驗及抑菌物質(zhì)效價測定
制備1.5%的瓊脂平板,等間距放入4個經(jīng)過高溫滅菌后的牛津杯。將金黃色葡萄球菌ATCC29213株接種在TSB培養(yǎng)基中37℃恒溫培養(yǎng)過夜。制備200 mL含0.7%瓊脂的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基(0.7%TSA培養(yǎng)基),冷至50℃左右,將過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌ATCC29213株調(diào)整至0.5麥?zhǔn)媳葷?1.5×108 CFU/mL),按1%的接種量接種2 mL稀釋后的金黃色葡萄球ATCC29213株菌液,混勻。在放置牛津杯的素瓊脂平板上倒入15 mL含有金黃色葡萄球菌ATCC29213株的0.7%TSA培養(yǎng)基,晾干后用無菌鑷子取出牛津杯,在孔中加入100μL分離的乳酸菌無菌發(fā)酵上清液(按照1.2.6中原液組的方法制備),在超凈工作臺中鼓風(fēng)擴(kuò)散3 h后,放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16~24 h觀察,并用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑,計算抑菌物質(zhì)效價。
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