[目的]本研究旨在明確纖維二糖利用基因簇對巴氏鏈球菌生長及毒力的影響。[方法]以肺炎鏈球菌基因組中纖維二糖利用基因簇為參考，同源性比對分析豬源巴氏鏈球菌WUSP067中纖維二糖利用基因簇，通過熒光定量PCR(RT-qPCR)、RT-PCR、缺失株構(gòu)建、不同條件下的生長曲線測定、小鼠毒力試驗等評價其對巴氏鏈球菌生長及毒力的影響。[結(jié)果]巴氏鏈球菌WUSP067基因組中存在2個潛在的纖維二糖利用相關(guān)基因簇(cellobiose locus，CL)，將其分別命名為CL1和CL2，它們均包括編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)和β-葡萄糖苷酶的基因。RT-qPCR結(jié)果顯示，與添加10 g·L-1葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基相比，在添加10 g·L-1纖維二糖的DMEM培養(yǎng)基中，CL1中的BglP1wp和BglAwp基因表達(dá)量無顯著差異，而CL2中celAwp和celBwp基因表達(dá)極顯著上調(diào)(P<0.000 1)，分別上調(diào)49倍和33倍，提示其參與利用纖維二糖。選擇CL2深入研究，RT-PCR結(jié)果顯示，該基因簇由2個操縱子組成。構(gòu)建編碼β-葡萄糖苷酶的celAwp基因缺失株，生長曲線分析表明，野生株和celAwp基因缺失(ΔcelAwp)株在THB、DMEM+10 g·L-1 葡萄糖條件下生長情況無明顯差異，但在DMEM+10 g·L-1纖維二糖條件下，野生株能以纖維二糖為唯一碳源生長，而ΔcelAwp表現(xiàn)出明顯的生長缺陷，生長12 h時D600仍低于0.5。以斷奶仔鼠為感染模型，比較野生株和ΔcelAwp株的毒力，每鼠攻毒劑量為3×108 CFU，野生株攻毒組小鼠3日內(nèi)全部死亡，而ΔcelA株攻毒組的小鼠死亡趨勢較緩，14 d后存活率為20%(P<0.05)。[結(jié)論]豬源巴氏鏈球菌WUSP067能以纖維二糖為唯一碳源生長，CL2是纖維二糖利用相關(guān)基因簇，其中celAwp基因不僅促進(jìn)該菌利用纖維二糖，而且還影響該菌的毒力，在巴氏鏈球菌致病過程中發(fā)揮作用。
引言
巴氏鏈球菌(Streptococcus pasteurianus)是一種革蘭陽性球菌，曾屬于牛鏈球菌生物型Ⅱ/2，后通過sodA(編碼超氧化物歧化酶)基因系統(tǒng)發(fā)育樹將其劃分為一個新的物種即巴氏鏈球菌。該菌能感染包括鴿子、火雞、鵝、牛、犬、猿和亞洲象等多種動物，主要引起敗血癥和腦膜炎癥狀，具有較高的死亡率。該菌也是人畜共患病原菌，可引致新生兒、老人和免疫缺陷患者心內(nèi)膜炎、尿路感染和孕婦的宮內(nèi)感染等癥狀，甚至死亡，還可能與人的胃腸道惡性腫瘤、肝癌有關(guān)。本課題組首次證實該菌可引致豬的腦膜炎，是豬鏈球菌病的新病原，由此建立了該菌的小鼠感染模型，且明確莢膜是重要的毒力因子; 此外，該菌還可定殖在表觀健康豬的扁桃體和肺門淋巴結(jié)，且在不同地區(qū)檢出率存在差異。目前，關(guān)于巴氏鏈球菌的報道主要是少量的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，對其致病機(jī)制的了解十分有限。因此，深入研究巴氏鏈球菌致病機(jī)制具有重要科學(xué)意義。
纖維二糖是一種常見的β-葡萄糖苷，由2個葡萄糖構(gòu)成，以β-1，4糖苷鍵連接，廣泛存在于植物中，哺乳動物的日常飲食中含有纖維素，攝入后經(jīng)腸道微生物降解產(chǎn)生纖維二糖。另外，哺乳動物胞外基質(zhì)富含糖胺聚糖，當(dāng)它降解時，會釋放出纖維二糖的類似物。在大腸桿菌中，這些類似物會誘導(dǎo)纖維二糖相關(guān)基因的表達(dá)。病原菌在感染宿主過程中，纖維二糖是潛在的碳源，其有助于病原菌在宿主體內(nèi)存活與增殖，肺炎克雷伯菌和艱難梭菌在感染過程中可以利用纖維二糖促進(jìn)它們在腸道中的競爭優(yōu)勢進(jìn)而增強(qiáng)毒力。肺炎鏈球菌中缺失纖維二糖利用相關(guān)基因BglA3(編碼β-葡萄糖苷酶)導(dǎo)致該菌對小鼠的致病性下降。由此可見，纖維二糖利用在細(xì)菌感染致病過程中發(fā)揮重要的作用，而關(guān)于巴氏鏈球菌對纖維二糖利用的研究尚未見報道。
本研究以肺炎鏈球菌基因組中纖維二糖利用基因簇為參考，分析豬源巴氏鏈球菌WUSP067基因組中纖維二糖利用基因簇，通過熒光定量PCR、缺失株的構(gòu)建、不同條件下生長曲線的測定、小鼠毒力試驗等，評價其對巴氏鏈球菌生長及毒力的影響，為深入了解巴氏鏈球菌致病機(jī)制及該類疫病防控提供參考。
相關(guān)新聞推薦
2、不同濃度芍藥苷對鮑曼不動桿菌生長曲線、生物被膜形成的影響（一）