研究簡介：乳酸菌通常與發(fā)酵食品有關(guān)。由于它們“普遍被認(rèn)為是安全的”稱號以及對動物和人類健康腸道微生物群的貢獻(xiàn)，這些細(xì)菌通常被用作益生菌。益生菌的許多健康益處已被報道，例如恢復(fù)腸道微生物群的平衡、支持免疫系統(tǒng)和改善一些心理健康狀況。但許多研究人員認(rèn)為，為了發(fā)揮其有益作用，益生菌需要在含有膽汁的腸道中存活。為了讓益生菌在腸道中保持足夠的數(shù)量，膽汁抵抗很重要，因?yàn)樗鼪Q定了益生菌在胃腸道中的存活能力。因此膽汁酸耐受性是選擇益生菌菌株的主要標(biāo)準(zhǔn)。然而，這個選擇過程是勞動密集型和耗時的。
為了以合理和高通量的方式選擇對膽汁具有高抗性的菌株，研究人員使用了Bioscreen c全自動生長曲線分析儀來篩選對膽汁有高抗性的菌株。BSH是一種重要的蛋白質(zhì)，參與植物乳桿菌對膽汁酸的耐受性。有必要研究特定菌株的不同bsh基因在其抗不同膽汁酸毒性中的作用。植物乳桿菌是一種廣泛研究和使用的益生菌，具有悠久的安全應(yīng)用歷史，植物乳桿菌攜帶四個bsh基因（bsh 1、bsh 2、bsh 3和bsh 4）。在這項(xiàng)研究中，植物乳桿菌的單、雙和三bsh敲除突變體AR113是用CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建的，以評估單個bsh基因?qū)Σ煌懼峒庸さ呢暙I(xiàn)，包括甘膽酸(GC)、甘鵝去氧膽酸(GCDC)、甘氨去氧膽酸(GDC)、?；悄懰猁}(TC)、牛磺鵝去氧膽酸鹽(TCDC)和牛磺脫氧膽酸鹽(TDC)。該研究將提供證據(jù)，有助于合理高通量選擇對膽汁酸具有高耐受性的菌株。
為了評估AR113和bsh敲除的植物乳桿菌菌株的生長，使用自動光密度監(jiān)測系統(tǒng)Bioscreen C全自動生長曲線分析儀確定了MRS培養(yǎng)基中每個菌株的生長狀態(tài)。將來自七種菌株的調(diào)整培養(yǎng)液的接種物（3%，v/v）接種到滅菌的MRS肉湯中。然后將各單獨(dú)接種的菌液各200μL分別加入蜂窩板的單獨(dú)孔中，將板置于Bioscreen C儀器中進(jìn)行監(jiān)測，溫度為37℃。針對相應(yīng)的未接種空白樣品，每30分鐘測量一次600 nm處的吸光度。對每個樣品進(jìn)行三個生物學(xué)重復(fù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：研究發(fā)現(xiàn)菌株的膽汁鹽耐受性受到bsh 1和bsh 3的影響，這可以通過bsh 1或bsh 3缺失突變體相對于AR113暴露于膽汁鹽時的細(xì)胞活力降低來證明。迄今為止許多研究都集中在建立BSH活性和膽汁鹽抗性之間的關(guān)系上。然而，尚未獲得一致的結(jié)果。該研究不僅建立了個體bsh基因與BSH活性之間的關(guān)系，而且揭示了bsh 1和bsh 3與甘氨酸結(jié)合膽汁鹽抗性的關(guān)系。研究表明CRISPR-Cas9系統(tǒng)是構(gòu)建bsh突變體的有效方法。BSH對甘氨酸結(jié)合膽汁鹽具有底物偏好。此外研究結(jié)果證實(shí)了bsh 1和bsh 3是植物乳桿菌AR113中大部分BSH活性和膽汁鹽抗性的原因。對BSH蛋白的進(jìn)一步研究是必要的，這將有助于了解BSH在膽汁鹽抗性中的機(jī)制，從而改善人類健康和疾病。
圖1、質(zhì)粒和bsh敲除菌株的構(gòu)建。(A)敲除質(zhì)粒的構(gòu)建過程。(B)敲除質(zhì)粒pLdbsh 1、2、3、4的構(gòu)建。泳道：M，DNA標(biāo)記；1、pHSP01；2-5，pLdbsh 1-4。(C)bsh單敲除菌株Δbsh 1、2、3、4的構(gòu)建。bsh 1：泳道：M，DNA標(biāo)記；1-15,Δbsh 1;16，AR113。bsh 2：泳道：M，DNA標(biāo)記；1、AR113；2-12，Δbsh 2。bsh 3：泳道：M，DNA標(biāo)記；1-12,Δbsh 3;13，AR113。bsh 4：泳道：M，DNA標(biāo)記；1-15,Δbsh 4;16，AR113。
圖2、本研究中使用的細(xì)菌菌株和質(zhì)粒。
圖3、敲除菌株的生長和BSH活性。(A)Bsh敲除菌株在MRS中的生長曲線(B)用5 mM?；撬峤Y(jié)合膽汁鹽定性檢測MRS中BSH活性(C)用5 mM甘氨酸結(jié)合膽汁鹽定性檢測MRS中BSH活性。從圖A中科院看出MRS肉湯中敲除菌株和AR113的生長期和最大生物量沒有顯著差異。這些結(jié)果表明植物乳桿菌AR113的生長在正常生長條件下不受bsh基因敲除的影響。圖B中可以看出在含有5%TAC、TDC和TCDC的MRS板上未觀察到沉淀環(huán)，這表明這三種膽汁鹽沒有被任何研究菌株水解。圖C顯示了與牛磺酸結(jié)合的膽汁鹽相比，甘氨酸結(jié)合的膽汁鹽在MRS板上產(chǎn)生清晰的沉淀圈。
圖4、BSH對不同膽汁鹽的影響。(A)bsh敲除?；撬峤Y(jié)合膽汁鹽的生長曲線。(B)bsh敲除甘氨酸結(jié)合膽汁鹽的生長曲線。圖A表示AR113的生長不受TAC、TDC和TCDC濃度的影響，可能是因?yàn)锽SH對?；撬峤Y(jié)合膽汁鹽的水解作用極其有限。AR113對GC、GDC和GCDC表現(xiàn)出不同水平的抗性，但在測試濃度下對任何甘氨酸結(jié)合膽汁鹽的耐受性沒有不同水平（圖B所示）。
圖5、BSH對甘氨酸結(jié)合膽汁鹽耐受性的影響。bsh敲除在MRS中的生長曲線，(A)0.3 g/L GC(B)3.0 g/L GC(C)5.0 g/L GC(D)0.3 g/L GDC(E)3.0 g/L GDC(F)5.0 g/L GDC(G)0.3 g/L GCDC(H)3.0 g/L GCDC(I)5.0 g/L GCDC。與AR113相比，0.3 g/L GC膽汁鹽處理后bsh敲除菌株的生長沒有明顯變化。當(dāng)GC濃度增加到3.0 g/L時，AR113的生長狀態(tài)不受影響，AR113的最大比生長速率為0.52 OD600/h。Δbsh 2、Δbsh 3和Δbsh 4的生長與AR113的生長沒有顯著差異。然而，bsh 1缺失菌株（Δbsh 1、Δbsh 13、Δbsh 132和Δbsh134)受到顯著抑制，這些菌株的最大比生長速率分別降低至0.25、0.20、0.21和0.22 OD600/h。這研究結(jié)果表明，bsh 1和bsh 3與膽汁鹽耐受性密切相關(guān)，菌株、膽汁類型和膽汁濃度對膽汁鹽耐受性有顯著影響。
總結(jié)：益生菌對膽汁鹽的抗性對其在腸道中的存活至關(guān)重要。膽汁鹽水解酶(BSH)催化結(jié)合膽汁鹽的去結(jié)合，并被認(rèn)為與膽汁鹽抗性有關(guān)。本研究旨在探討不同bsh基因在植物乳桿菌AR113膽汁鹽抗性中的作用。CRISPR-Cas9基因編輯用于構(gòu)建單、雙和三bsh敲除菌株。發(fā)現(xiàn)bsh 1和bsh 3基因的功能對植物乳桿菌中的BSH活性至關(guān)重要AR113。對六種膽汁鹽的檢查表明，甘氨酸結(jié)合的膽汁鹽是BSH的首選底物。當(dāng)用甘氨酸結(jié)合膽汁鹽處理時，bsh1或bsh3敲除菌株的生長受到顯著抑制。然而具有bsh2或bsh4敲除的菌株不受影響。這些結(jié)果表明bsh 1和bsh 3與膽鹽抗性密切相關(guān)。該結(jié)果將有助于合理、高通量地選擇對膽汁鹽具有高耐受性的菌株。研究人員研究敲除基因的植物乳桿菌的生物活性使用了高通量的全自動生長曲線分析儀(Bioscreen C)篩選了對膽汁有高抗性的植物乳桿菌菌株，這些研究數(shù)據(jù)將提供證據(jù)，有助于合理高通量選擇對膽汁酸具有高耐受性的菌株。