本文旨在以海區(qū)具有代表性的優(yōu)勢海洋細(xì)菌濃度加富的方法，選用防污涂料中廣泛使用的防污劑和實(shí)驗(yàn)室自制防污劑為受試化合物，以凝膠板模擬涂層進(jìn)行室內(nèi)模擬淺海掛板，以探索基于海洋細(xì)菌生長曲線變化。
測定OD值并繪制OD-t生長曲線
取200μL各受試菌懸液于96孔板中，分別向各孔板中加入1μL不同濃度的防污劑，以加入1μL純?nèi)軇〥MSO的孔板作為對(duì)照，以添加對(duì)應(yīng)濃度防污劑的液體培養(yǎng)基作為空白，用酶標(biāo)儀在600nm波長下測定其OD值(楊浩等，1996;喬軍等，2002;馬勇等，2011)。將96孔板置于25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，期間每隔1—2 h測定并記錄菌懸液的OD值，繪制3種受試菌在不同條件板孔中的生長曲線，得到各種防污劑的最小抑制濃度MIC。
受試菌的生長曲線及MIC
3種受試菌在幾種不同濃度防污劑溶液影響下的生長曲線，可以很直觀地反應(yīng)出5種試驗(yàn)防污劑的抑菌效果(Marionet al，2008)，見圖1、圖2、圖3、圖4、圖5。
由圖1—圖5可以看出，隨著防污劑CPT、TBTO和ZPT濃度的升高，3種受試菌的生長逐漸受到抑制，當(dāng)溶液濃度達(dá)分別到0.97×10–3mg/mL、1.99×10–3mg/mL和1.91×10–3mg/mL時(shí)，三種防污劑對(duì)受試菌均表現(xiàn)出明顯的抑制作用。
圖1 CPT對(duì)三種受試菌生長曲線的影響
圖2 TBTO對(duì)三種受試菌生長曲線的影響
圖3 ZPT對(duì)三種受試菌生長曲線的影響
圖4 DCDMA對(duì)三種受試菌生長曲線的影響
圖5 Diuron對(duì)三種受試菌生長曲線的影響
對(duì)于CPT，整體來看，其抑菌性隨濃度增加而增加。但是，當(dāng)濃度達(dá)到0.97×10–3mg/mL后，繼續(xù)增大濃度，抑菌效果僅有輕微增加;并且隨時(shí)間延長，受試菌呈平穩(wěn)生長狀態(tài);對(duì)于TBTO，在各個(gè)試驗(yàn)濃度下，均表現(xiàn)出了很好的抑菌效果，且濃度變化對(duì)抑菌效果影響不大。但隨時(shí)間的延長，在17.5h時(shí)，受試菌生長速率明顯加快，這或許和細(xì)菌的生長周期有關(guān);對(duì)于ZPT，在濃度低于1.91×10–3mg/mL時(shí)，抑菌效果不是太明顯，當(dāng)濃度達(dá)到1.91×10–3mg/mL時(shí)，才表現(xiàn)出明顯的抑菌性，繼續(xù)增大濃度對(duì)其影響不大。
由圖3可以看出，當(dāng)溶液濃度達(dá)到8.46×10–3mg/mL時(shí)，DCDMA才對(duì)三種受試菌表現(xiàn)出輕微的抑制作用，但當(dāng)濃度繼續(xù)增加時(shí)，抑菌效果并沒有增加，這可能是因?yàn)槿芤褐械腄CDMA已達(dá)到飽和狀態(tài)。相較于前三種防污劑，DCDMA的防污效果并不十分顯著。
由圖5中3種受試菌的生長曲線可以看出，Diuron對(duì)海洋細(xì)菌的正常生長幾乎沒有影響，當(dāng)濃度高達(dá)0.493mg/mL時(shí)，依然沒有明顯抑制作用。印證了前面室內(nèi)掛板的結(jié)果。
結(jié)果
測定OD-t生長曲線的方法，在殺菌劑的檢測中已經(jīng)得到應(yīng)用(孫世春等，1999;陳默等，2009)。此法在本研究中作為一種輔助方法，不但對(duì)防污劑的防污效果做出了定量的大小比較，而且對(duì)防污劑在實(shí)際防污涂料中的用量問題，給予一定的參考值。室內(nèi)短期掛板實(shí)驗(yàn)，采用幾種菌在海水中混合培養(yǎng)的人工加富濃度模式，與實(shí)海(淺海掛板)情況更接近，比測試單一某種菌種的抑菌性更具實(shí)際意義，且其24h抑菌率與OD-t生長曲線法所得結(jié)果一致。因此，本研究方法對(duì)于海洋防污劑的評(píng)價(jià)具有可靠性。
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