草魚(Ctenopharyngodon idellus)屬鯉形目鯉科雅羅魚亞科草魚屬，一種草食性魚類，飼養(yǎng)成本低，養(yǎng)殖地域廣，是我國(guó)淡水養(yǎng)殖的重要品種，除新疆，青藏高原外，在我國(guó)各地均有養(yǎng)殖，也是廣東省的淡水主養(yǎng)品種之一。但是草魚養(yǎng)殖期間易發(fā)生病害問(wèn)題，其中以病毒性出血病最甚，對(duì)我國(guó)草魚養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。草魚呼腸孤病毒(Grass carpreovims，GCRV)感染導(dǎo)致的草魚出血病已經(jīng)成為制約草魚產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要因素之一。目前，對(duì)于草魚出血病的防治，還沒(méi)有特異有效的治療藥物和方法，最為有效的辦法仍然是免疫預(yù)防。魚類細(xì)胞系正是研究病毒感染途徑、感染機(jī)理以及研制病毒疫苗的重要研究體系。因此，建立草魚細(xì)胞系，是進(jìn)行草魚呼腸孤病毒的分離與鑒定，研究其致病機(jī)理，疫苗制備和免疫預(yù)防技術(shù)的重要基礎(chǔ)。
迄今為止，雖然有草魚腎臟細(xì)胞系(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，左文功，水產(chǎn)學(xué)報(bào)，1986,10(1):11-16)、草魚吻端組織細(xì)胞株ZC-7901及其亞株ZC-7901S1(浙江省淡水水產(chǎn)研究所，張念慈，水產(chǎn)學(xué)報(bào)，1981,5(2)：111-119)吻端成纖維細(xì)胞系PSF(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，國(guó)家科技成果，2005，S943.112；S941.411)、草魚尾鰭組織二倍體細(xì)胞系(中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，魏彥章，水生生物學(xué)報(bào)，1986,10(3):293-294)、草魚囊胚細(xì)胞系、肝細(xì)胞系等幾個(gè)細(xì)胞系的文獻(xiàn)報(bào)道，但是仍未見(jiàn)腦細(xì)胞系的報(bào)道。
草魚腦組織的制備：
鮮活草魚于75％酒精中浸泡1～2min，置于超凈臺(tái)中無(wú)菌取下腦組織，用PBS漂洗2遍后，置于5ml的無(wú)菌青霉素小瓶中(含5％(v/v)胎牛血清的M199培養(yǎng)液)，用手術(shù)剪將其剪成約1mm3
碎塊，加入5ml PBS收集至15ml離心管，1000rpm離心3min，離心收集組織塊后棄去上清，重復(fù)一次。加入組織塊約10倍體積的0.25％胰蛋白酶，37℃消化20min。加入培養(yǎng)液終止消化，用200目尼龍紗網(wǎng)過(guò)濾至新的一次性培養(yǎng)皿中，加入5ml細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗紗網(wǎng)再過(guò)濾一次，將濾過(guò)液收集至15ml離心管中，離心去上清，收集細(xì)胞。紗網(wǎng)上的組織塊可以再重復(fù)消化，過(guò)濾。用含20％(v/v)FBS(胎牛血清)的M199培養(yǎng)液充分懸浮細(xì)胞，即得到草魚腦細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液均勻接種于25cm2的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)條件為27℃，5％CO2。
草魚腦細(xì)胞培養(yǎng)液的配制：
M199培養(yǎng)液(GIBCO)(pH值為7.0～7.4)加入20％(v/v)胎牛血清(Hyclone)。細(xì)胞傳至10代以后，胎牛血清添加量減至10％(v/v)。
草魚腦細(xì)胞原代培養(yǎng)的啟動(dòng)：
用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，于27℃，5％CO2中培養(yǎng)；腦細(xì)胞遷出后，每隔3～5天換液一次，以去除未貼壁的組織和死細(xì)胞；細(xì)胞在完全培養(yǎng)液中生長(zhǎng)狀態(tài)良好，增殖明顯。
草魚腦細(xì)胞的培養(yǎng)條件研究
草魚腦細(xì)胞最佳培養(yǎng)基的確定
選擇DMEM、M199、MEM、L-15四種細(xì)胞培養(yǎng)基，并添加終濃度為10％(v/v)的FBS制備細(xì)胞培養(yǎng)液。調(diào)整細(xì)胞密度為4×105個(gè)/mL，四種培養(yǎng)基各按2.5mL/孔的量接種于6孔板，于27℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每1d從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組里取出3孔細(xì)胞，用Trypsin-EDTA消化法收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，共培養(yǎng)7d，連續(xù)計(jì)數(shù)7次，繪制其生長(zhǎng)曲線。確定其最適培養(yǎng)基為M199或L-15培養(yǎng)基。
草魚腦細(xì)胞最適血清濃度的確定
分別配制FBS濃度為5％、10％、15％、20％(v/v)的培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105個(gè)/mL，四種血清濃度培養(yǎng)基各按2.5mL/孔的量接種于6孔板，于27℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每1d從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組里取出3孔細(xì)胞，用Trypsin-EDTA消化法收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，共培養(yǎng)7d，連續(xù)計(jì)數(shù)7次，繪制其生長(zhǎng)曲線。
草魚腦細(xì)胞最適培養(yǎng)溫度的確定
選擇15℃、22℃、27℃、32℃四個(gè)不同培養(yǎng)溫度，使用添加10％FBS的DMEM培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105
個(gè)/mL，細(xì)胞懸液按2.5mL/孔的量接種于6孔板并置于于四個(gè)不同培養(yǎng)溫度培養(yǎng)箱里。每1d從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組里取出3孔細(xì)胞，用Trypsin-EDTA消化法收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，共培養(yǎng)7d，連續(xù)計(jì)數(shù)7次，繪制其生長(zhǎng)曲線。
草魚腦細(xì)胞群體倍增時(shí)間測(cè)定
取60代細(xì)胞接種于六孔板，使其終濃度為4×105細(xì)胞/mL，置27℃培養(yǎng)。每隔1d收集3個(gè)孔中的培養(yǎng)細(xì)胞，混勻后用Countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，連續(xù)測(cè)定7d。以培養(yǎng)時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞濃度(細(xì)胞/mL)為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)公式T＝t×lg2/lg(Nt/N0)計(jì)算細(xì)胞的群體倍增時(shí)間，經(jīng)計(jì)算第60代CIB群體倍增時(shí)間為31.664h，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。其中，N0為接種細(xì)胞數(shù)，Nt為時(shí)間t后的細(xì)胞數(shù)。
草魚腦細(xì)胞對(duì)草魚出血病病毒(GCRV)的敏感性：
以第60代草魚腦細(xì)胞為對(duì)象，檢測(cè)草魚出血病病毒(GCRV)對(duì)該細(xì)胞的敏感程度。密度為4×105個(gè)mL-1細(xì)胞接種24小時(shí)后，將病毒103TCID50/mL溶液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，1小時(shí)后，移去病毒溶液，更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，約2天后，觀察到細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)后，將細(xì)胞做電鏡切片觀察。透射電鏡結(jié)果顯示，在草魚腦細(xì)胞系中觀察到大量GCRV病毒粒子。
草魚腦細(xì)胞CIB最適培養(yǎng)基為M199培養(yǎng)基，最適胎牛血清濃度為10％，最適生長(zhǎng)溫度為27℃，生長(zhǎng)曲線正常，可以進(jìn)行連續(xù)傳代，也可以對(duì)其進(jìn)行冷凍保存。以草魚呼腸孤病毒(GCRV)病毒感染細(xì)胞系可以檢測(cè)到病毒粒子的存在，證實(shí)草魚腦細(xì)胞系可以直接應(yīng)用于病毒感染試驗(yàn)及疫苗研究。同時(shí)，該細(xì)胞對(duì)羅非魚湖病毒TiLV敏感，可用于羅非魚湖病毒病原學(xué)研究及羅非魚湖病毒病防控產(chǎn)品開發(fā)。
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