摘要：【目的】構(gòu)建牛種布魯氏菌(B.abortus)A19株效應(yīng)蛋白BspE基因缺失株，探究其生長(zhǎng)特性及在宿主細(xì)胞中的生存、黏附及入侵能力，并觀察BspE蛋白的亞細(xì)胞定位情況?！痉椒ā恳耘７N布魯氏菌A19為研究對(duì)象，運(yùn)用同源重組及SacB反向篩選技術(shù)構(gòu)建布魯氏菌效應(yīng)蛋白BspE基因缺失株A19ΔBspE，并通過(guò)質(zhì)?；匮a(bǔ)方法構(gòu)建其回補(bǔ)株A19CΔBspE，比較3種菌株在體外的生長(zhǎng)特性；通過(guò)平板計(jì)數(shù)方法分析BspE基因缺失對(duì)布魯氏菌在細(xì)胞內(nèi)的生存及黏附和入侵細(xì)胞能力的影響；通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)BspE蛋白在RAW264.7細(xì)胞中的定位情況?！窘Y(jié)果】菌液PCR結(jié)果顯示，獲得大小為2 060 bp的特異性條帶，成功構(gòu)建BspE基因缺失株A19ΔBspE；Western blotting結(jié)果顯示，獲得大小約為14.59 ku的BspE-flag條帶，成功構(gòu)建回補(bǔ)株A19CΔBspE。生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示，在相同的培養(yǎng)條件下，A19ΔBspE與牛種布魯氏菌A19、A19CΔBspE的生長(zhǎng)趨勢(shì)沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，均在8 h達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，32 h進(jìn)入平臺(tái)期。胞內(nèi)增殖試驗(yàn)結(jié)果顯示，在感染48 h內(nèi)，A19ΔBspE在RAW264.7細(xì)胞中的生存能力與牛種布魯氏菌A19、A19CΔBspE無(wú)顯著差異(P＞0.05)。細(xì)菌黏附和入侵試驗(yàn)結(jié)果顯示，A19ΔBspE黏附和入侵RAW264.7細(xì)胞的能力與牛種布魯氏菌A19、A19CΔBspE沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示，BspE蛋白主要分布于核周區(qū)域?！窘Y(jié)論】本研究證實(shí)了BspE基因的缺失不影響布魯氏菌在體外的生長(zhǎng)及在RAW264.7細(xì)胞中的生存、黏附及入侵能力，且BspE蛋白主要定位在核周區(qū)域，為后續(xù)研究布魯氏菌效應(yīng)蛋白BspE的生物學(xué)功能和致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
布魯氏菌病(brucellosis)是一種由布魯氏菌引起的人獸共患病，對(duì)人類健康及畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展構(gòu)成了極大的威脅。目前，布魯氏菌病的防控主要依靠減毒活疫苗，雖然起到了重要的防控作用，但也存在一些問(wèn)題，如干擾診斷、殘存毒力及孕畜流產(chǎn)等。許多胞內(nèi)寄生菌通過(guò)分泌效應(yīng)蛋白來(lái)促進(jìn)它們?cè)谒拗骷?xì)胞中的生存和增殖。布魯氏菌通過(guò)分泌多種毒力因子逃避機(jī)體的免疫應(yīng)答，在機(jī)體內(nèi)生存和增殖。IV型分泌系統(tǒng)(type IV secretion system，T4SS)是布魯氏菌重要的毒力因子，其所分泌的效應(yīng)蛋白對(duì)布魯氏菌在細(xì)胞中的生存和感染后的免疫反應(yīng)具有調(diào)控作用。目前已發(fā)現(xiàn)17個(gè)與T4SS相關(guān)的效應(yīng)蛋白，分別為VceA、VceC、RicA、BPE005、BPE043、BPE123、BPE275、BtpA、BtpB、SepA、BspA、BspB、BspC、BspE、BspF、BspJ及BspL，它們?cè)诓剪斒暇腥舅拗鞯倪^(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在這些效應(yīng)蛋白中，BspE蛋白的功能尚不清楚，從目前的研究分析來(lái)看，BspE包含螺旋線圈和跨膜結(jié)構(gòu)域，主要參與形成離散的囊泡，但其在布魯氏菌感染宿主細(xì)胞過(guò)程中的作用尚不清楚。為探究效應(yīng)蛋白BspE的功能和作用，本研究構(gòu)建牛種布魯氏菌A19效應(yīng)蛋白BspE基因缺失株和回補(bǔ)株，研究其對(duì)布魯氏菌體外生長(zhǎng)變化及在RAW264.7細(xì)胞中生存、黏附和入侵能力的影響，為進(jìn)一步探究BspE的生物學(xué)功能及致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1主要試劑
牛種布魯氏菌A19疫苗株、PUC19-SacB、pET-28a(+)和pBBR1MCS質(zhì)粒及小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所草食動(dòng)物細(xì)菌病團(tuán)隊(duì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;Donkey Anti-Rabbit IgG H&L(Alexa Fluor®)及Donkey Anti-Mouse IgG H&L(Alexa Fluor®647)二抗購(gòu)自Abcam公司;Primer STAR Max Premix購(gòu)自百奧基生物科技有限公司;ClonExpress®Ultra One Step Cloning Kit、DNA Marker均購(gòu)自蘭州賽維斯生物科技有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購(gòu)自蘭州博瑞生物科技有限公司;蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、一抗稀釋液、ECL Super Kit均購(gòu)自武漢愛博泰克生物科技有限公司;Anti-DDDDK Tag Antibody購(gòu)自上海生基生物科技有限公司;辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購(gòu)自甘肅偉博鑫生物科技有限公司。
1.1.2主要儀器
恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水槽均購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司;電泳儀購(gòu)自北京六一生物科技有限公司;微生物生長(zhǎng)曲線分析儀，Bioscreen公司；PCR儀、垂直電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、電穿孔儀均購(gòu)自Bio-Rad公司;離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司;生物安全柜購(gòu)自蘇州安泰公司。
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