1.2.3菌落PCR鑒定
以菌落為模板，采用2×Phanta®Max Master Mix（Dye Plus）酶進行菌落PCR鑒定。反應體系為：滅菌蒸餾水8.5 mL，2×Phanta®Max 12.5 mL，菌液模板2.0 mL，上下游引物各1.0 mL，共25.0 mL。反應條件為：94℃2 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃50 s，30個循環(huán)。
1.2.4病毒拯救
在轉染前1 d，將鋪滿單層90%以上的BHK-21細胞鋪于6孔細胞培養(yǎng)板中，將菌落PCR鑒定正確的SVA重組質粒通過脂質體Lipofectamine 3000按照試劑盒建議的試驗方案進行轉染，同時轉染EGFP N2質粒觀察轉染效率，置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后觀察轉染效率；成功轉染的細胞反復凍融3次，8 000 r/min離心5 min收獲上清，將上清重新接種于新的BHK-21細胞，盲傳3代（F3），觀察細胞病變情況，收集發(fā)生病變的細胞毒。
1.2.5拯救病毒鑒定
將拯救的病毒傳至第5代（F5），收獲病毒培養(yǎng)液，通過天隆DNA/RNA磁珠法全自動核酸提取試劑盒，采用HiScript®III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）進行反轉錄，同時清除DNA以排除轉染質粒對測序結果的干擾。依據(jù)2017年廣東SVA全基因序列（登錄號：MG428683.1），設計7對引物（表2），能夠擴增出部分重疊、覆蓋SVA全基因組序列的7條片段。以cDNA為模板，進行PCR擴增。反應體系為：滅菌蒸餾水19 mL，2×Phanta®Max 25 mL，cDNA模板2 mL，上下游引物各2 mL，共50 mL。反應條件為：94℃2 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃50 s，30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳陽性條帶切膠后送生工生物技術公司測序。
表2拯救病毒鑒定用引物序列
1.2.6生長曲線分析
將傳至第5代的拯救毒株與親本毒株（MOI=0.1）分別接種鋪滿單層BHK-21細胞的96孔板中，每種毒株3次重復，吸附1 h，PBS洗滌2次，加入含2%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。在接種后6、12、18、24 h分別收獲病毒，測定不同時間點病毒TCID50，繪制病毒生長曲線，比較拯救毒株與親本毒株的增殖特性。
1.2.7間接免疫熒光試驗
在12孔板中接種BHK-21細胞，待細胞生長至90%，分別接種rSVA與親本毒株（MOI=0.1），同時設置陰性對照；接毒18 h后，以4%冰冷多聚甲醛固定細胞10 min；PBS洗滌3次后用5%BSA溶液封閉，孵育特異性SVA一抗（針對VP2蛋白），PBS洗滌后孵育FITC標記的二抗，在熒光顯微鏡下觀察結果。
1.2.8噬斑形成試驗
將拯救毒株與親本毒株樣品連續(xù)10倍稀釋后分別接種BHK-21細胞，放置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中感染1 h；棄去病毒液，用PBS洗滌細胞2～3次；將低熔點瓊脂糖與2×DMEM（體積比為1:1）混合后以2 mL/孔加入6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d；在顯微鏡下觀察，當產(chǎn)生明顯噬斑后用4%甲醛溶液固定細胞3 h，每孔加入0.5 mL 1%結晶紫室溫染色0.5 h；水洗去染色液，進行噬斑形態(tài)觀察。
2結果
2.1 SVA感染性克隆構建策略
SVA基因組全長較短，僅7.3 kb，可采用高保真酶一步法擴增。同時幾個基因元件擴增引物設計好同源臂，使pWSK-29載體5'端到3'端依次重組進CMV、SVA全基因組、poly（A）+HDVr（圖1）。
圖1 pWSK-29-SVA感染性克隆示意圖
2.2 SVA全基因組及相關基因片段PCR擴增
如圖2所示：以SVA-GXT91 RNA為模板擴增出長度約為7.3 kb的SVA病毒基因片段；以引物為模板，通過退火自結合方式擴增出了poly（A）+HDVr；以EGFP N2質粒為模板，擴增出了CMV啟動子。
圖2 SVA全基因組與poly（A）+HDVr、CMV片段PCR擴增結果
2.3同源重組及菌落PCR鑒定
將pWSK-29質粒經(jīng)SacI/HindIII雙酶切線性化，在同源重組酶ExnaseMulitS催化下，將CMV啟動子、SVA全基因組、polyA+HDVr依次重組進pWSK-29載體，構建出pWSK-29-SVA重組質粒。將重組質粒pWSK-29-SVA轉化至感受態(tài)細胞，過夜培養(yǎng)后，利用鑒定引物對菌落進行PCR鑒定并測序。經(jīng)鑒定，所構建的SVA感染性克隆質粒完全符合預期設計（圖3）。
圖3 pWSK-29-SVA菌落PCR鑒定結果
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