摘要：利用從杭州農(nóng)藥廠活性污泥中篩選到的一株新型高效降解尼古丁的菌株Shinella sp.HZN7為對象，通過正交試驗(yàn)對影響菌株生長的pH值、溫度、氯化鈉、葡萄糖、轉(zhuǎn)速等條件參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，得出了其在實(shí)驗(yàn)室條件下的最佳生長條件.通過在土壤中添加煙草廢棄物，利用該高效尼古丁降解菌株Shinella sp.HZN7對模擬煙草廢棄物污染土壤進(jìn)行生物修復(fù)的土壤實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)表明：添加菌株的處理組與不加菌株的對照組相比，在尼古丁的去除能力、pH值穩(wěn)定性、含水率保持等方面均有較大改善，以及對土壤有機(jī)質(zhì)量的變化產(chǎn)生一定的影響，且在一定范圍內(nèi)，隨著煙草廢棄物添加量的增大，生物修復(fù)的效果越明顯。
菌源
菌株HZN7(申氏桿菌屬，Shinellasp.)為本實(shí)驗(yàn)室分離，保藏至中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 2013060.
培養(yǎng)基
LB培養(yǎng)基(Luria-Bertani medium):含10.0 g/L蛋白胨，5.0 g/L酵母膏和10.0 g/L氯化鈉，pH7.0.
煙草廢棄物
取自杭州利群卷煙廠，120℃烘干至恒重，密封.
供試土壤
采自浙江工業(yè)大學(xué)校園內(nèi)菜地表層土(0～20 cm)，采集土樣預(yù)處理：多點(diǎn)采樣，去除雜物，自然風(fēng)干，研磨均勻，過1 mm(30目)篩后，室溫保存[7].
正交試驗(yàn)
通過比較不同pH值、溫度、氯化鈉、葡萄糖、轉(zhuǎn)速對菌體生長的影響，從中篩選出菌株HZN7的最佳生長條件，確定影響因子的影響順序[8-9].依據(jù)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過改變pH值、溫度、轉(zhuǎn)速、添加、減少或者改變培養(yǎng)基中某些組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，配制成不同體系的液體培養(yǎng)基.然后按5%的接種量接入在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期的HZN7(OD600=0.90，菌體用無菌水洗滌2次)，搖床培養(yǎng)12 h.取2 mL菌液，6 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入等體積去離子水混勻，稀釋至適當(dāng)濃度后，用紫外可見分光光度計(jì)在600 nm波長下測定吸光度。
菌株HZN7最佳生長條件的正交試驗(yàn)
本實(shí)驗(yàn)采用5因素3水平設(shè)計(jì)(表1)，以L18(35)設(shè)計(jì)，每一種組合分別設(shè)3個(gè)重復(fù).根據(jù)K值、R值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，K值表示的是同一因素各水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果之和，k值表示K值的平均值，K值的大小則反映該因素中各水平對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的大小.R(極差)為同一因素中kmax-kmin，根據(jù)極差的大小可以判斷各因素對實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響主次，R值的大小說明該因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的大小，R值越大，說明該因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響越大，R值越小則說明該因素的影響越小。
表1各因素水平列表
表2 L 18(3 5)正交試驗(yàn)結(jié)果
注：1)A，B，C，D，E分別代表相應(yīng)的因素，下標(biāo)代表其對應(yīng)的水平.
由表2可知：根據(jù)正交試驗(yàn)的結(jié)果，菌株HZN7的最佳生長條件pH值為7.0，葡萄糖10 g/L，氯化鈉10 g/L，溫度40℃，轉(zhuǎn)速180 r/min.按上述條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，搖床培養(yǎng)12 h，菌株HZN7的OD600達(dá)到1.517.由此可知，A2B3C2D3E2為菌株的最佳生長條件，且各因素的影響順序?yàn)镃>A>B>E>D。
3結(jié)論
本研究對菌株HZN7的生長條件進(jìn)行了優(yōu)化，菌株HZN7在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中(葡萄糖10 g/L，氯化鈉10 g/L，pH控制7.0)，置于40℃，180 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12 h，菌體生長量達(dá)到最大，OD600達(dá)到1.517.該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后期在工業(yè)上大量生產(chǎn)高效尼古丁降解菌HZN7提供了一定的指導(dǎo)性作用.尼古丁高效降解菌在土壤中降解煙草廢棄物的實(shí)驗(yàn)表明：在不同量煙草廢棄物污染程度下，添加菌株HZN7的處理組與不添加菌株的對照組，尼古丁的去除率得到明顯提升，且煙草廢棄物添加量在100 g時(shí)，對于尼古丁的去除，土壤的修復(fù)效果最佳.同時(shí)添加了高效降解菌HZN7的土壤，對于維持土壤pH值、含水率、改變微生物的群落結(jié)構(gòu)起到了積極的作用，為后續(xù)對于煙草廢棄物污染的土壤的修復(fù)，做出了一定的理論貢獻(xiàn)。
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