研究簡(jiǎn)介
φR1-37是一種大型噬菌體，屬于Myoviridae科，能夠感染多種耶爾森菌血清型。其基因組為262,391 bp，包含367個(gè)蛋白編碼基因和5個(gè)tRNA編碼基因。研究中，通過在不同溫度下進(jìn)行生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)φR1-37在4°C至37°C的溫度范圍內(nèi)均能有效感染宿主細(xì)菌，且感染效率隨溫度升高而增加。RNA測(cè)序結(jié)果顯示，隨著感染時(shí)間的推移，宿主轉(zhuǎn)錄本逐漸被噬菌體轉(zhuǎn)錄本所取代，噬菌體轉(zhuǎn)錄本的比例從感染后2分鐘的3.27%增加到49分鐘的15.71%。本研究人員通過RNA測(cè)序技術(shù)深入探究了噬菌體φR1-37與宿主細(xì)菌小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica）之間的相互作用，揭示了φR1-37在溶菌感染過程中的全基因組轉(zhuǎn)錄模式以及對(duì)宿主細(xì)菌生理的影響。研究結(jié)果表明，φR1-37的基因表達(dá)模式與典型的溶菌噬菌體不同，其多數(shù)基因在整個(gè)感染過程中呈組成性表達(dá)，而宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組在感染過程中發(fā)生了顯著變化，包括一些特定基因的上調(diào)表達(dá)，這些基因與應(yīng)激反應(yīng)和膜穩(wěn)定性相關(guān)。研究為理解噬菌體與宿主之間的相互作用提供了新的視角，并為進(jìn)一步研究新型抗菌劑和噬菌體療法的發(fā)展提供了基礎(chǔ)。通過揭示φR1-37獨(dú)特的基因表達(dá)模式和宿主轉(zhuǎn)錄組的變化，本研究強(qiáng)調(diào)了噬菌體在感染過程中對(duì)宿主代謝的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制，以及宿主在應(yīng)激條件下的適應(yīng)性反應(yīng)。
Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀的應(yīng)用
Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀（Bioscreen C）被用于研究噬菌體φR1-37在不同溫度條件下對(duì)宿主細(xì)菌小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica）的感染動(dòng)力學(xué)。使用Y.enterocolitica O:3菌株YeO3-R1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)菌在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)16小時(shí)，然后按1:10的比例稀釋到新鮮的LB培養(yǎng)基中，總體積為10 mL。在細(xì)菌培養(yǎng)的OD600值達(dá)到0.6時(shí)，將培養(yǎng)物分為兩部分：一部分用于感染噬菌體φR1-37（感染組），另一部分作為未感染的對(duì)照組（對(duì)照組）。感染組中加入噬菌體φR1-37，使其感染復(fù)數(shù)（MOI）為10；對(duì)照組中加入等量的培養(yǎng)基作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)在不同溫度下進(jìn)行，包括4°C、10°C、16°C、22°C和37°C。使用Bioscreen進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將180μL的細(xì)菌培養(yǎng)物與20μL的噬菌體懸浮液（或?qū)φ张囵B(yǎng)基）混合在微孔板中。在設(shè)定的溫度下，每隔一定時(shí)間測(cè)量培養(yǎng)物的OD600值，以監(jiān)測(cè)細(xì)菌的生長(zhǎng)變化。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
φR1-37的基因表達(dá)模式與典型的溶菌噬菌體不同。大多數(shù)基因在整個(gè)感染過程中呈組成性表達(dá)，而不是典型的早期、中期和晚期基因的階段性表達(dá)模式。這種表達(dá)模式表明φR1-37可能依賴其自身的RNA聚合酶（RNAP）來維持整個(gè)感染過程中的基因表達(dá)。感染早期，約2.58%的Y.enterocolitica基因表達(dá)水平下降，表明噬菌體感染對(duì)宿主基因表達(dá)有顯著抑制作用。感染晚期，54.2%的差異表達(dá)基因被上調(diào)，包括ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、Cpx系統(tǒng)、噬菌體-冷-滲透壓休克蛋白等，這些基因可能與宿主的應(yīng)激反應(yīng)和膜穩(wěn)定性相關(guān)。這種上調(diào)可能反映了宿主對(duì)噬菌體感染的適應(yīng)性反應(yīng)，或者噬菌體對(duì)宿主代謝的調(diào)控。揭示了φR1-37基因組中存在10個(gè)新的非編碼RNA種類，包括9個(gè)反義RNA（asRNA）和1個(gè)內(nèi)基因RNA。這些非編碼RNA可能在噬菌體-宿主相互作用中發(fā)揮調(diào)控作用，例如通過干擾宿主mRNA的轉(zhuǎn)錄或翻譯。噬菌體感染過程中宿主基因的上調(diào)表達(dá)可能是一種復(fù)雜的適應(yīng)性反應(yīng)，噬菌體可能利用宿主的某些基因產(chǎn)物來完成其生命周期。這種相互作用可以被視為噬菌體與宿主之間的一種“軍備競(jìng)賽”，宿主試圖抵御感染，而噬菌體則試圖利用宿主的資源來完成其生命周期。
圖1、在不同溫度下感染噬菌體φR1-37的YeO3-R1細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。在4℃(A)、10℃(B)、16℃(C)、22℃(D)和37℃(E)下，在LB中培養(yǎng)感染了MOI為10?1到10?5的噬菌體φR1-37的細(xì)菌。圖中的每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表八次重復(fù)的平均值。誤差線代表為每個(gè)時(shí)間點(diǎn)計(jì)算的光密度的標(biāo)準(zhǔn)差。
圖2、感染后不同時(shí)間點(diǎn)比對(duì)到φR1-37噬菌體基因組的RNA測(cè)序讀數(shù)的百分比。
圖3、φR1-37基因組轉(zhuǎn)錄在感染周期中的進(jìn)程。將比對(duì)到噬菌體基因組雙鏈每條鏈上每250bp片段的讀數(shù)的數(shù)量針對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行繪制(A)。曲線從灰色到黑色的顏色強(qiáng)度表示連續(xù)的時(shí)間點(diǎn)(關(guān)于圖A的高分辨率圖像，見圖S4)。φR1-37基因表達(dá)的不同時(shí)間類別(B)。對(duì)于每個(gè)基因和感染階段，最高的基因總讀數(shù)(TGR)值被設(shè)為100%，其他值相應(yīng)設(shè)定。基因被分為四個(gè)時(shí)間類別，曲線代表為這些類別計(jì)算的平均值。
圖4、在噬菌體φR1-37感染周期中細(xì)菌基因表達(dá)的變化。早期階段數(shù)值代表為2和5分鐘時(shí)間點(diǎn)計(jì)算的平均數(shù)據(jù)，晚期階段數(shù)值代表為28、35、42和49分鐘時(shí)間點(diǎn)計(jì)算的平均值。顯示的是早期階段與陰性對(duì)照之間的Log2FC值(A)、晚期階段與陰性對(duì)照之間的Log2FC值(B)以及晚期階段與早期階段之間的Log2FC值(C)。每個(gè)點(diǎn)代表為每個(gè)基因單獨(dú)計(jì)算的Log2FC值。在A、B和C圖中，點(diǎn)根據(jù)它們?cè)赮eO3-R1基因組中的基因位置排序(X軸上連續(xù)的基因編號(hào)由底部的比例尺指示)?；揖€指示選定的差異表達(dá)閾值±1.5。圖D、E和F表明，在早期階段，大多數(shù)差異表達(dá)的宿主基因被抑制(D)，而在晚期階段，許多差異表達(dá)的宿主基因被激活(E)，當(dāng)晚期階段基因與早期階段基因比較時(shí)，這一點(diǎn)更加明顯(F)。
總結(jié)
對(duì)細(xì)菌病毒(噬菌體)的興趣日益增長(zhǎng)，但關(guān)于噬菌體在細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育及其對(duì)細(xì)菌生理學(xué)影響的見解仍然很少。研究人員研究了在裂解性感染過程中，巨型噬菌體vB_YecM_φR1-37(φR1-37)及其宿主——引起胃腸炎的細(xì)菌小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)的全基因組轉(zhuǎn)錄情況。RNA測(cè)序顯示，φR1-37的基因表達(dá)并不遵循在其他裂解性噬菌體中觀察到的典型模式，因?yàn)橹挥胁糠只蚩梢员粴w類為典型的早期、中期或晚期基因。大多數(shù)基因似乎在整個(gè)感染過程中持續(xù)表達(dá)。研究表明轉(zhuǎn)錄主要發(fā)生在正鏈上，而負(fù)鏈僅編碼低到中等表達(dá)水平的基因。有趣的是，還檢測(cè)到了反義RNA(antisense RNA)的存在，以及一種非編碼的基因內(nèi)RNA(non-coding intragenic RNA)。噬菌體感染細(xì)胞中的基因表達(dá)特征在于宿主轉(zhuǎn)錄物被噬菌體轉(zhuǎn)錄物廣泛取代。然而在感染晚期，宿主應(yīng)答的特征也包括幾種已知參與應(yīng)激反應(yīng)和膜穩(wěn)定性的特定細(xì)菌基因產(chǎn)物的上調(diào)，包括Cpx通路調(diào)節(jié)因子、ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、噬菌體休克蛋白和冷休克蛋白。
通過Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀，研究者能夠系統(tǒng)地評(píng)估噬菌體φR1-37在不同溫度下對(duì)Y.enterocolitica的感染效率和宿主細(xì)菌的生長(zhǎng)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，φR1-37能夠在較寬的溫度范圍內(nèi)有效感染宿主細(xì)菌，且感染效率隨溫度升高而增加。這一發(fā)現(xiàn)為后續(xù)的RNA測(cè)序分析提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，幫助研究者選擇合適的感染條件（如室溫下MOI=10）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。本研究為理解噬菌體與宿主之間的相互作用提供了新的視角，并為進(jìn)一步研究新型抗菌劑和噬菌體療法的發(fā)展提供了基礎(chǔ)。通過深入了解噬菌體感染機(jī)制和宿主響應(yīng)機(jī)制，可以為開發(fā)新的抗菌策略提供理論支持。
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