奇異變形桿菌是醫(yī)院感染，特別是尿路感染中非常重要的病原體之一。由于其對多粘菌素和替加環(huán)素（治療CRE“三劍客”之二）的固有耐藥，碳青霉烯耐藥奇異變形桿菌的的出現(xiàn)尤為令人關(guān)注;特別是那些產(chǎn)生金屬酶NDM-1的菌株，使臨床治療極其困難。
NDM-1的傳播是是全球公共健康面臨的一項重大挑戰(zhàn)。blaNDM-1基因在多種遺傳背景中被發(fā)現(xiàn)，但最常與可移動的遺傳元件有關(guān)。整合接合元件（Integrating Conjugative Element，ICE）是一種可自我傳播的移動遺傳元件，能夠從宿主染色體上切除，形成可通過接合轉(zhuǎn)移到受體細(xì)菌的環(huán)形中間體。ICE已被證明與臨床上重要的耐藥基因的廣泛傳播有關(guān)。
研究過程早在2015年，我們在杭州一家醫(yī)院ICU的一個尿路感染患者分離到一株奇異變形桿菌（命名為XH1653），該菌株除了氨曲南外對所有受試的抗菌藥物均耐藥（這種表型提示該菌株可能含有金屬酶）。全基因組數(shù)據(jù)顯示，大多數(shù)耐藥基因聚于一簇，且含有雙拷貝的碳青霉烯耐藥基因blaNDM-1（圖1），最后通過分析發(fā)現(xiàn)其實這些耐藥基因均位于一個新型SXT/R391家族ICE中(命名為ICEPmiChnXH1653)。
圖1 BacAnt:細(xì)菌DNA序列的組合注釋服務(wù)器，用于識別抗生素抗性基因、整合子和轉(zhuǎn)座元件
研究結(jié)果BLAST分析結(jié)果顯示，該ICE與北京分離到的奇異變形桿菌中的ICEPmiCHN905相似，只在可變區(qū)VRIII和高頻插入位點區(qū)HS4兩個區(qū)域中存在差異；HS4區(qū)大約有73.75 kb大，擁有19個耐藥基因，是由ISPpu12復(fù)合轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)形成（兩端有轉(zhuǎn)座標(biāo)志TSD序列），與分離自四川的一株奇異變形桿菌中發(fā)現(xiàn)的ICEPmiBCP11中的HS4高度同源，最主要的差別是我們的ICE擁有floR基因和blaNDM-1基因，而blaNDM-1則由ISCR1復(fù)合轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)并形成串聯(lián)拷貝（圖2）。blaNDM-1的遺傳環(huán)境與已報道的攜帶blaNDM-1的奇異變形桿菌PM58質(zhì)粒和大腸桿菌Y5染色體相同。這是首次在奇異變形桿菌中的ICE發(fā)現(xiàn)了多拷貝blaNDM-1。
圖2攜帶雙拷貝NDM-1的奇異變形桿菌XH1653的基因型特征
除了序列分析之外，我們繼續(xù)對該ICE的生物學(xué)特征進(jìn)行了詳細(xì)研究。我們通過PCR檢測到ICEPmiChnXH1653環(huán)狀中間體的存在，接合實驗表明該ICE可以轉(zhuǎn)移到大腸埃希菌EC600中，接合效率為1.5×10?7，與供體株相比，受體株的ICE具有更高的切除頻率和染色體外拷貝數(shù)。我們還觀察到ICEPmiChnXH1653的存在會對宿主細(xì)菌的適應(yīng)性產(chǎn)生負(fù)面影響，并導(dǎo)致宿主轉(zhuǎn)錄組的變化（圖3）。
圖3 ICEPmiChnXH1653的生物學(xué)特性。XH1814為接合子（擁有ICEPmiChnXH1653的EC600）
為了探索ICE帶給宿主負(fù)擔(dān)的相關(guān)補償機制，我們進(jìn)行了體外傳代實驗，然而由于對照菌株EC600本身也產(chǎn)生了適應(yīng)性進(jìn)化，因此無法確定相關(guān)突變是針對ICE負(fù)擔(dān)產(chǎn)生的。然而，在無抗菌藥物壓力條件下的體外進(jìn)化實驗和基因組數(shù)據(jù)表明，雙拷貝的碳青霉烯耐藥基因blaNDM-1所在的ISCR1轉(zhuǎn)座子片段以及氯霉素耐藥基因floR所在的ISVsa3轉(zhuǎn)座子片段在連續(xù)傳代過程中能夠發(fā)生丟失（圖4），使得宿主細(xì)菌恢復(fù)了對碳青霉烯類抗菌藥物的敏感性，證實ICEPmiChnXH1653通過ISCR1介導(dǎo)的滾環(huán)傳播機制進(jìn)行同源重組獲得碳青霉烯酶基因。
圖4 ICEPmiChnXH1815的遺傳結(jié)構(gòu)。XH1815為XH1814傳代后發(fā)生NDM-1丟失的菌株。
結(jié)論我們首次報道攜帶兩個blaNDM-1串聯(lián)拷貝的新型SXT/R391家族ICE，同時也說明了該ICE作為耐藥基因積累和傳播平臺的重要作用。此外，ISCR1轉(zhuǎn)座子或ICE對blaNDM-1的傳播可能是導(dǎo)致碳青霉烯類抗菌藥物跨物種耐藥的重要因素。
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