豬丹毒絲菌（E.rhusiopathiae）屬于丹毒絲菌屬，是一種兩端鈍圓，直或稍彎曲的細絲狀菌，大小為（0.2～0.4）μm×（0.8～2.5）μm，呈革蘭氏陽性，有莢膜，無鞭毛，易形成長絲狀。該菌能引起豬和多種動物的急性、熱性感染，臨床上急性型呈敗血癥癥狀，亞急性型皮膚上出現(xiàn)紫色疹塊，慢性型表現(xiàn)為關節(jié)炎和心內(nèi)膜炎。豬丹毒絲菌的血清型有1a、1b、2、4、5、6、8、11、12、15、16、17、19、21和N等，不同血清型致病力不同，其中1a、1b的致病力最強，目前我國主要流行1a和2型。
豬丹毒絲菌主要感染架子豬，也可經(jīng)損傷的皮膚感染人。豬丹毒病20世紀80年代以前在我國多發(fā)，隨著養(yǎng)殖條件的改善和疫病防控水平的提高，20世紀90年代后期至21世紀初期，關于豬丹毒絲菌感染的報道較為少見。然而，2010年開始，我國部分省份零星報道發(fā)現(xiàn)豬丹毒病例，至2012年，豬丹毒病例顯著增多，廣西、廣東、四川、福建、江西、湖南、安徽、上海、吉林、黑龍江等地均報道發(fā)生該病。據(jù)統(tǒng)計，2017—2019年，我國豬丹毒病的平均檢出率為4.2%，是豬瘟的3倍、藍耳病的48倍，豬丹毒絲菌感染率呈明顯上升趨勢，亟需加強防控。
免疫接種是預防和控制豬丹毒病發(fā)生和流行的重要手段?！吨腥A人民共和國獸藥典》（2020年版，以下簡稱《獸藥典》）收錄相關疫苗有豬丹毒活疫苗G4T10株、GC42株，豬瘟、豬丹毒、豬多殺性巴氏桿菌病三聯(lián)活疫苗，豬丹毒滅活疫苗，豬丹毒、豬多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗等5個產(chǎn)品，上述疫苗產(chǎn)品生產(chǎn)用菌種均為豬丹毒絲菌C43-5株。該菌種由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所負責檢定、保管和供應?，F(xiàn)行檢定依據(jù)為《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》（2000年版，以下簡稱《規(guī)程》）。由于《規(guī)程》中未明確標明該菌的攻毒劑量上限，所以試驗過程中可以無限加大攻毒劑量，故檢定結(jié)果中無法描述菌株毒力，不能有效控制疫苗質(zhì)量。因此，本研究開展了豬丹毒滅活疫苗生產(chǎn)用菌種C43-5株對豬的最小致死量研究，并對1986、1996、2006、2015年4個凍干代次的菌種進行了毒力和免疫原性測定，以期為進一步修訂完善毒力檢定標準，延長菌種保存期提供依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株
生產(chǎn)用豬丹毒絲菌CVCC43005株（2型），檢驗用豬丹毒絲菌CVCC43008株（1型）、CVCC43006株（2型），均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。
1.1.2主要試劑
TSA培養(yǎng)基，購自BD公司；馬丁湯，購自北京中海動物保健科技公司；馬血清，購自Gibco公司；肉肝胃消化湯、綿羊裂解血細胞全血、豬丹毒活疫苗活菌計數(shù)用參考品（8.5×108～12.5×108CFU/頭份）、豬丹毒抗體競爭ELISA檢測試劑盒，均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。
1.1.3實驗動物
ICR小鼠（SPF級、16～18 g、雌性），購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；豬（普通級、56～63日齡、雌雄各半），購自隆安實驗動物中心。
1.2方法
1.2.1 TSA培養(yǎng)基配制及質(zhì)量控制
稱取40 g TSA溶于940 mL注射用水，121℃滅菌15 min備用。取豬丹毒活疫苗活菌計數(shù)用參考品3瓶，按照《獸藥典》進行活菌計數(shù)。培養(yǎng)平板為含10%馬血清、0.2%綿羊裂解血細胞全血的TSA平板，培養(yǎng)條件為33℃，培養(yǎng)時間為42 h。
1.2.2 CVCC43005株培養(yǎng)及制備工藝確定
將CVCC43005株凍干菌種用1.0 mL肉肝胃消化湯復溶后，取0.5 mL接種于含5%馬血清、0.2%綿羊裂解血細胞全血、0.4%葡萄糖的10.0 mL肉肝胃消化湯中，33℃靜置培養(yǎng)20 h；取新鮮菌液劃線接種于含10%馬血清、0.2%綿羊裂解血細胞全血的TSA平板，33℃培養(yǎng)42 h，作為一級種子；從一級種子上選取3個典型菌落接種于含5%馬血清、0.2%綿羊裂解血細胞全血、0.4%葡萄糖的10.0 mL肉肝胃消化湯（置于100 mL鹽水瓶）中，33℃120 r/min培養(yǎng)12 h，作為二級種子；取2.0 mL二級種子接種于含5%馬血清、0.2%綿羊裂解血細胞全血、0.4%葡萄糖的100.0 mL肉肝胃消化湯（置于250 mL三角瓶）中，33℃120 r/min培養(yǎng)，從培養(yǎng)1 h開始，每間隔1 h取1次樣，進行活菌計數(shù)，直至培養(yǎng)24 h后結(jié)束。
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