2結(jié)果
2.1病原的分離純化
患病牛肺臟處理液接種PPLO液體培養(yǎng)基，傳代培養(yǎng)至第2代可見培養(yǎng)基由紅變黃并保持澄清。將第3代培養(yǎng)物涂布于PPLO固體培養(yǎng)基，3~5天后可見表面光滑、針尖大小的白色小菌落生長（圖1A）。在40-100X顯微鏡下觀察，菌落呈典型的邊緣整齊的“煎蛋樣”形態(tài)（圖1B）。經(jīng)過3輪液體-固體克隆純化后獲得純培養(yǎng)物，命名為YJ-22。
圖1 YJ-22分離株菌落形態(tài)
(A)固體培養(yǎng)基上的菌落（肉眼觀）；(B)顯微鏡下的菌落形態(tài)（40-100X，“煎蛋樣”）。
2.2 PCR及測序鑒定結(jié)果
使用特異性引物MB-P48-F/MB-P48-R擴(kuò)增純化的YJ-22菌株DNA，在約526 bp處獲得單一的、與陽性對照一致的清晰條帶，陰性對照無條帶（圖2）。測序結(jié)果顯示該片段為M.bovis P48基因的部分序列。GenBank BLAST比對分析表明，該序列與參考菌株M.bovis MJ-1(CP042938.1)、M.bovis DADC51(CP040775.1)、M.bovis VK30(CP058467.1)等相應(yīng)區(qū)域序列的相似性均高于99.3%，確認(rèn)為牛支原體。
圖2 YJ-22分離株P(guān)48基因PCR擴(kuò)增結(jié)果
M：DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：YJ-22分離株；2：陰性對照（ddH?O）；3：陽性對照（M.bovis標(biāo)準(zhǔn)株DNA）。
2.3生化鑒定結(jié)果
YJ-22分離株的生化反應(yīng)結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，該菌株不能發(fā)酵葡萄糖或甘露醇，不能水解精氨酸或明膠，不分解尿素，但能利用乳糖。這些生化特征完全符合牛支原體的典型特性。
表1 YJ-22分離株生化鑒定結(jié)果
2.4生長曲線繪制
根據(jù)間隔取樣測定的CCU LOG值，繪制了YJ-22分離株在PPLO液體培養(yǎng)基中的生長曲線（圖3）。結(jié)果顯示，該菌株接種后經(jīng)歷短暫遲緩期（約9小時(shí)），隨后進(jìn)入快速對數(shù)生長期（9-18小時(shí)）。在18至45小時(shí)間，活菌數(shù)維持在一個(gè)較高的平臺期（1×10?~1×10?CCU/mL）。45小時(shí)后進(jìn)入衰亡期，活菌數(shù)逐漸下降，至60小時(shí)降至約1×10?CCU/mL。
圖3 YJ-22分離株在PPLO液體培養(yǎng)基中的生長曲線
2.5 YJ-22分離株致病性研究結(jié)果
2.5.1臨床癥狀
攻毒組（2頭犢牛）在攻毒后第9天均開始出現(xiàn)明顯的臨床癥狀：咳嗽（尤其驅(qū)趕時(shí)）、喘氣、呼吸頻率加快、兩側(cè)鼻孔有漿液性/粘液性分泌物增多。在攻毒后第3天，兩頭攻毒牛體溫均開始升高（比攻毒前基礎(chǔ)體溫升高約0.7~1.0℃），高體溫狀態(tài)持續(xù)約3天后逐漸恢復(fù)至正常水平（圖4）。對照組（2頭犢牛）在整個(gè)觀察期內(nèi)精神、食欲、呼吸均正常，體溫保持平穩(wěn)（圖4），未見咳嗽、流涕等任何異常。攻毒組牛未見明顯的關(guān)節(jié)炎癥狀。
圖4攻毒試驗(yàn)中犢牛的體溫變化曲線
(攻毒組數(shù)據(jù)點(diǎn)為平均值，攻毒時(shí)間為第0,1,2天)。
2.5.2排菌情況
對試驗(yàn)期間采集的所有鼻拭子樣品進(jìn)行M.bovis分離培養(yǎng)和PCR檢測。攻毒前所有試驗(yàn)牛的鼻拭子均為陰性。攻毒后，對照組鼻拭子始終陰性。攻毒組兩頭牛在攻毒后第1天（即首次攻毒后）即可檢出病原，在隨后監(jiān)測的22天內(nèi)多次檢測為陽性（分離鑒定和PCR結(jié)果一致），顯示持續(xù)性排菌。具體檢測陽性率（陽性采樣點(diǎn)數(shù)/總采樣點(diǎn)數(shù)）：攻毒1號牛為40%（4/10），攻毒2號牛為50%（5/10）（表2）。
2.5.3剖檢病變
攻毒后第21天剖檢所有試驗(yàn)牛。對照組兩頭牛的肺臟肉眼觀察均正常，色澤粉紅，質(zhì)地柔軟有彈性，未見明顯的實(shí)變、出血或膿腫，偶見個(gè)別點(diǎn)狀出血或輕微粘連（屬于背景病變）。參考Maunsell等標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病變評分：對照組1號牛得1分，2號牛得2分，表明肺部無明顯M.bovis相關(guān)損傷。
攻毒組兩頭牛的肺臟均呈現(xiàn)嚴(yán)重的廣泛性病變（圖5A,B）。肺臟表現(xiàn)為大面積的肉變（肺實(shí)變）、肝變（質(zhì)地如肝）、明顯的充血和出血灶，病變區(qū)域與健康區(qū)域界限清晰。這些病變主要分布在肺的尖葉、心葉和膈葉前緣。攻毒1號牛病變評分9分，攻毒2號牛病變評分11分。其他臟器未見M.bovis相關(guān)的特異性病變。
圖5攻毒試驗(yàn)犢牛肺臟剖檢病變
(A)攻毒1號牛肺：廣泛性肉變、肝變及出血；(B)攻毒2號牛肺：嚴(yán)重的肉變、肝變及出血灶；(C)對照1號牛肺：正常；(D)對照2號牛肺：正常（偶見點(diǎn)狀出血）。
2.5.4病理組織學(xué)觀察
對照組牛的肺臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)正常：肺泡大小均勻，間隔清晰，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤，細(xì)支氣管上皮完整（圖6C,D）。
攻毒組牛的肺組織顯示出嚴(yán)重的病理改變（圖6A,B）：肺泡結(jié)構(gòu)廣泛破壞，大量肺泡腔實(shí)變、塌陷；肺間質(zhì)增厚，血管擴(kuò)張充血；可見明顯的局灶性或片狀出血區(qū)域；肺泡腔內(nèi)、細(xì)支氣管腔內(nèi)及肺間質(zhì)內(nèi)可見大量以單核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）為主的炎性細(xì)胞浸潤，并伴有不同程度的嗜中性粒細(xì)胞浸潤；部分區(qū)域可見纖維結(jié)締組織增生（早期纖維化改變）。這些病理變化特征符合牛支原體肺炎的慢性支氣管間質(zhì)性肺炎表現(xiàn)。
圖6攻毒試驗(yàn)犢牛肺臟組織病理學(xué)變化(H&E染色)
(A)攻毒1號牛：肺結(jié)構(gòu)破壞，實(shí)變區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤（箭頭），間質(zhì)增寬；(B)攻毒2號牛：肺泡腔融合實(shí)變（），間質(zhì)及肺泡腔大量炎性細(xì)胞浸潤（箭頭），出血（#）；(C)對照1號牛：肺泡結(jié)構(gòu)正常；(D)對照2號牛：肺泡結(jié)構(gòu)正常。(標(biāo)尺：100μm).
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