1.2.4噬菌體形態(tài)觀察
參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中關(guān)于噬菌體顆粒的PEG/NaCl沉淀提取法進(jìn)行噬菌體純化顆粒制備，噬菌體顆粒溶于SM緩沖液中，4℃保存?zhèn)溆?；用?fù)染色法對(duì)噬菌體顆粒進(jìn)行染色，取20μL噬菌體顆粒與20μL濃度為0.5%的戊二醛混合，滴在銅網(wǎng)上靜置15 min，使噬菌體顆粒固定。用2%的磷鎢酸對(duì)噬菌體顆粒進(jìn)行負(fù)染色1-2 min，用濾紙吸干多余液體，用透射電鏡在80 kV電壓下觀察。拍照并儲(chǔ)存。
1.2.5噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection,MOI）測(cè)定
將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，OD600nm≈0.2，菌液濃度約為1×109 CFU/mL的宿主菌液，與已知滴度的噬菌體液（2×109 CFU/mL）倍比稀釋，按照噬菌體滴度與宿主菌濃度的比值分別為100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1的比例混勻，37℃，160 r/min培養(yǎng)4 h，取出后用0.45μm濾器過濾，濾液倍比稀釋后測(cè)定各體系下的噬菌體滴度，滴度最高的體系的比值即噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)，重復(fù)3次。
1.2.6噬菌體一步生長曲線及爆發(fā)量測(cè)定
取最佳MOI對(duì)應(yīng)的宿主菌液和噬菌體液各500μL，放入培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)10 min，將混合液8 000 r/min離心30 s，吸棄上清液，然后加入1 mL NB吹打使沉淀重懸，重復(fù)兩次。在錐形瓶中加入此懸液，再加19 mL營養(yǎng)肉湯，放入搖床，37℃，160 r/min，開始每5 min取樣1 mL，30 min后，每10 min取樣1 mL，至100 min停止取樣。每次取樣都需用0.45μm濾器過濾，然后暫時(shí)放入4℃保存，待全部取樣完成后，統(tǒng)一取出進(jìn)行倍比稀釋，測(cè)定噬菌體滴度，重復(fù)3次。
1.2.7噬菌體的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性試驗(yàn)
（1）噬菌體熱穩(wěn)定性。將噬菌體液分成4組，每組6 mL，分別放入50℃、60℃、70℃、80℃的水浴中，每隔10 min取1 mL噬菌體液稀釋10倍，防止高溫影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，暫時(shí)放入4℃保存，待全部取樣完成后，統(tǒng)一取出進(jìn)行倍比稀釋，測(cè)定噬菌體滴度，重復(fù)3次。
（2）噬菌體pH穩(wěn)定性。取1 mL的噬菌體液加入9 mL不同pH（1-14）的營養(yǎng)肉湯中，37℃恒溫培養(yǎng)1 h，取出后進(jìn)行倍比稀釋，用上文的方法測(cè)定噬菌體滴度，重復(fù)3次。
1.2.8噬菌體宿主范圍測(cè)定
將實(shí)驗(yàn)室保存的其他大腸埃希菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌全部復(fù)蘇并培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，取500μL菌液加入小試管中，再加入5 mL半固體培養(yǎng)基（50℃左右），混勻后使半固體培養(yǎng)基平鋪在瓊脂平板上，凝固后在中心處滴加2-3滴噬菌體液，晾干后37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日觀察各個(gè)平板中心是否出現(xiàn)噬菌斑。
1.2.9噬菌體DK-13全基因組測(cè)序及分析
按1.2.4方法獲得的500μL噬菌體濃縮液，加入2.5μL DNase I（1 mg/mL）和0.5μL RNase A（1 mg/mL），之后加入25μL EDTA，25μL蛋白酶K和20μL SDS，56℃水浴1 h,裂解噬菌體。隨后使用苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1）提取噬菌體DNA，送至杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行全基因組測(cè)序。使用在線軟件tRNAscan-SE預(yù)測(cè)噬菌體中是否含有tRNA;CG view展示序列中GC skew-和GC skew+等特性情況的圓形基因圖。
使用ORFs Finder預(yù)測(cè)噬菌體DK-13的開放閱讀框（ORF）；使用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）預(yù)測(cè)并注釋每個(gè)開放閱讀框的功能；使用VFDB（Virulence Factors of Pathogenic Bacteria）數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)噬菌體DK-13是否含有毒力基因；使用CARD（The Comprehensive Antibiotic Resistance Database）數(shù)據(jù)庫檢索預(yù)測(cè)噬菌體DK-13是否含有耐藥基因。
選取噬菌體DK-13的保守基因DNA連接酶進(jìn)行BLASTP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/），尋找同源性蛋白，再使用MEGA6（https://www.megasoftware.net/）軟件鄰域連接構(gòu)建噬菌體DNA連接酶的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系分析。
1.2.10細(xì)菌污染豬肉模型制備及不同溫度下噬菌體DK-13對(duì)污染豬肉的殺菌效果
將從超市購買的豬里脊肉部分用無菌刀片切成邊長約為2 cm的正方形薄片，用1 mL PBS緩沖液沖洗，紫外滅菌2 h，使肉片充分滅菌。滴加100μL濃度為1×107 CFU/mL的宿主菌液滴在肉片表面，使其充分接觸，靜置10 min，得到濃度為1×106 CFU/sample的EIEC污染的豬肉樣品，放入4℃冰箱保存。
取最佳感染復(fù)數(shù)的宿主菌液的噬菌體液滴在豬肉樣品表面，使其與樣品充分接觸進(jìn)行殺菌，對(duì)照組則滴加等體積的PBS緩沖液，分別放入4℃冰箱和37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h。每隔1 h取樣一次，加入裝有PBS緩沖液的離心管中，充分震蕩后在相應(yīng)溫度下，5 000 r/min離心1 min，吸棄上清后再加1 mL PBS緩沖液，重懸后在相應(yīng)溫度下5 000 r/min離心1 min，重復(fù)兩次。將最后一次懸液梯度稀釋，取100μL菌液均勻涂布在平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日對(duì)平板上菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。重復(fù)3次。
2結(jié)果
2.1噬菌體的分離及其滴度測(cè)定
從醫(yī)院未經(jīng)處理的污水中分離出了一株烈性噬菌體，命名為DK-13，采用雙層平板法純化后，得到了純化后的單一噬菌體，噬菌體DK-13的噬菌斑為圓形，透明且無暈環(huán)，直徑約為1-2 mm。結(jié)果如圖1-A所示。
圖1噬菌體DK-13的形態(tài)特征
A:噬菌體形態(tài)；B:透射電鏡形態(tài)
通過計(jì)算可以得出噬菌體DK-13的滴度約為2×109 PFU/mL。
2.2噬菌體形態(tài)學(xué)觀察
如圖1-B所示，噬菌體DK-13呈典型的蝌蚪狀外形，包含一個(gè)直徑約為100 nm的正二十面體的頭部和一個(gè)可收縮的螺旋對(duì)稱的尾部，根據(jù)ICTVdb數(shù)據(jù)庫的規(guī)則分類，噬菌體DK-13屬于有尾噬菌體目（Caudovirales）肌尾噬菌體科（Myoviridae）T4噬菌體亞科（Tevenvirinae）噬菌體。
2.3噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定
噬菌體DK-13與宿主菌EIEC的感染復(fù)數(shù)為0.01時(shí)，產(chǎn)生子代噬菌體的數(shù)量最多，效價(jià)為2.8×1010 PFU/mL,說明噬菌體DK-13的最佳感染復(fù)數(shù)為0.01（圖2-A）。
圖2噬菌體DK-13的生物學(xué)特性
A:噬菌體DK-13的MOI；B:噬菌體DK-13的一步生長曲線。不同小寫字母表示處理組別間有顯著差異（P<0.05)。下同
2.4噬菌體一步生長曲線及爆發(fā)量的測(cè)定
取最佳感染復(fù)數(shù)0.01對(duì)應(yīng)的宿主菌液和噬菌體液各500μL，測(cè)定不同時(shí)間噬菌體的滴度。以時(shí)間為橫軸，噬菌體滴度的對(duì)數(shù)為縱軸，繪制一部生長曲線。結(jié)果如圖2-B所示，噬菌體DK-13的潛伏期約為10 min，裂解期約為70 min，平均爆發(fā)量為164 PFU/cell。
2.5噬菌體穩(wěn)定性的測(cè)定
2.5.1噬菌體在不同溫度下的穩(wěn)定性
本試驗(yàn)測(cè)試了噬菌體DK-13在50℃、60℃、70℃和80℃的條件下，1 h之內(nèi)的活性情況。結(jié)果如圖3-A所示，在50℃和60℃時(shí)，噬菌體的活性幾乎不發(fā)生變化；70℃下噬菌體活性下降，20 min后完全失活；溫度升高至80℃，噬菌體10 min后完全失活。結(jié)果表明噬菌體DK-13受溫度影響較小。
圖3噬菌體DK-13的生物學(xué)特性
A:噬菌體DK-13的熱穩(wěn)定性；B:噬菌體DK-13的酸堿穩(wěn)定性
2.5.2噬菌體在不同pH下的穩(wěn)定性
噬菌體DK-13在pH 1-14的環(huán)境下，1 h之內(nèi)的存活情況測(cè)試結(jié)果如圖3-B所示：在pH 5-10的條件下，對(duì)噬菌體DK-13的活性并沒有很大的影響，噬菌體均體現(xiàn)了較高的活性；在pH 4或pH 11的條件下，噬菌體的活性略有下降，但依然有大量噬菌體存活；在pH<4或pH>11的條件下，幾乎檢測(cè)不到存活的噬菌體。
2.6噬菌體宿主范圍的測(cè)定
將實(shí)驗(yàn)室保存的其他15株大腸埃希菌，2株蠟樣芽孢桿菌，3株金黃色葡萄球菌全部復(fù)蘇并培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，用噬菌體DK-13進(jìn)行裂解測(cè)定，結(jié)果顯示噬菌體DK-13不能裂解以上任何細(xì)菌，只能裂解宿主菌EIEC。說明噬菌體DK-13的特異性非常強(qiáng)。詳細(xì)結(jié)果見表1。
表1噬菌體DK-13宿主范圍
2.7噬菌體全基因組分析
測(cè)序結(jié)果顯示：噬菌體DK-13基因組全長172 275 bp，GC含量為40.18%。tRNAscan-SE分析結(jié)果顯示：噬菌體DK-13基因組中含有tRNAMet、tRNAArg。噬菌體DK-13的全基因組信息已上傳至GenBank，登錄號(hào)為MT611523。
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