【背景】玉米迪克氏菌(Dickeya zeae)可引起作物細(xì)菌性軟腐病，嚴(yán)重威脅香蕉、水稻等重要作物的生產(chǎn)安全。本研究在香蕉細(xì)菌性軟腐病菌D.zeae MS1的Tn5突變體庫中篩選到4個(gè)毒力顯著減弱的突變體。
【目的】進(jìn)一步鑒定Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變體的具體基因位點(diǎn)，并明確該基因?qū)?xì)菌毒力的影響。
【方法】通過熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR(thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction,TAIL-PCR)鑒定轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)；利用同源重組方法構(gòu)建插入基因的敲除突變體及其互補(bǔ)菌株，并比較它們與野生型在細(xì)菌生長、相關(guān)代謝產(chǎn)物活性、植物細(xì)胞壁降解酶(plant cell wall-degrading enzymes,PCWDEs)分泌、運(yùn)動(dòng)性及毒力等方面的差異。
【結(jié)果】TAIL-PCR鑒定出4個(gè)突變體的轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)均是位于α-酮戊二酸脫氫酶(α-ketoglutarate dehydrogenase,α-KGDH)基因sucA內(nèi)，該基因編碼三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)過程的關(guān)鍵酶組分?；蚯贸蛔凅wΔsucA在細(xì)菌生長曲線上受到一定程度的影響，但是其α-KGDH活性完全喪失。基因突變可顯著減少PCWDEs的分泌并降低pelB和pelC等基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而不影響細(xì)菌的涌動(dòng)、游動(dòng)能力。對(duì)比野生型，ΔsucA在煙葉上產(chǎn)生的過敏性反應(yīng)明顯減弱，對(duì)香蕉幼苗的致病性也顯著降低?；匮a(bǔ)菌株則可將上述細(xì)菌表型均恢復(fù)至與野生型接近的水平?！窘Y(jié)論】本研究利用Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變鑒定到可影響細(xì)菌毒力的TCA關(guān)鍵酶基因sucA，該基因的突變可減弱重要毒力因子PCWDEs的分泌，但不影響細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性。
玉米迪克氏菌(Dickeya zeae)，原名Erwinia chrysanthemi pv.zeae，可引起香蕉、水稻、馬鈴薯和玉米等重要作物的細(xì)菌性軟腐病發(fā)生，并在全球范圍內(nèi)造成嚴(yán)重減產(chǎn)。在糧食作物上，由D.zeae引起的水稻基腐病和玉米細(xì)菌性莖腐病在易感品種或有利于病原菌生長的環(huán)境條件下發(fā)生較為普遍。在華南地區(qū)，由D.zeae引起的香蕉細(xì)菌性軟腐病最初在廣東省被發(fā)現(xiàn)，隨后迅速傳播至中國廣西、云南、海南和福建等地；由于病害傳播速度快、傳播范圍廣和發(fā)病癥狀嚴(yán)重，該病害已成為香蕉生產(chǎn)過程中的重要威脅。
目前，已報(bào)道的與迪克氏菌屬(Dickeya)侵染寄主植物相關(guān)的毒力因子主要包括：植物細(xì)胞壁降解酶(plant cell wall-degrading enzymes,PCWDEs)、細(xì)菌分泌系統(tǒng)、鞭毛運(yùn)動(dòng)性、群體感應(yīng)信號(hào)和細(xì)菌生物被膜等。不同毒力因子間多表現(xiàn)密切的聯(lián)系，果膠裂解酶(pectate lyase,Pel)和纖維素酶(cellulose,Cel)通過II型分泌系統(tǒng)(typeⅡsecretion system,T2SS)分泌至Dickeya胞外，蛋白酶(protease,Prt)則利用I型分泌系統(tǒng)(type I secretion system,T1SS)進(jìn)行分泌。在很多情況下，同一基因的突變?？捎绊懮鲜霾煌玖σ蜃拥淖饔?，并進(jìn)一步減弱細(xì)菌毒力，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因fis的敲除突變可減少PCWDEs的產(chǎn)生，降低細(xì)菌的游動(dòng)性和群集運(yùn)動(dòng)性，減少生物被膜的形成和zeamine毒素的產(chǎn)生，從而影響其對(duì)水稻種子的致病性；編碼MarR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的slyA發(fā)生突變后，D.zeae生物被膜形成能力、細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性和毒力均降低，并且其PCWDEs的產(chǎn)生也受到不同程度的影響；此外，研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)過氧化物還原酶調(diào)節(jié)因子(organic hydroperoxide reductase regulator,OhrR)可調(diào)節(jié)Cel的產(chǎn)生，并影響細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性、生物被膜形成及對(duì)于雙子葉植物和單子葉植物的毒力。
細(xì)菌的毒力調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜，除上述常見的毒力因子外，仍然有較多的毒力調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探討。如，三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)作為細(xì)胞中產(chǎn)生能量的關(guān)鍵代謝途徑，已有報(bào)道表明細(xì)菌可通過該途徑來影響細(xì)胞行為和毒力因子。在鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella enterica)中，多個(gè)TCA循環(huán)基因的突變導(dǎo)致其對(duì)于BALB/c小鼠上的毒力減弱；相較于鯰魚愛德華氏菌(Edwardsiella ictaluri)野生型，TCA循環(huán)基因突變體對(duì)鯰魚的毒力顯著減弱；在大腸桿菌(Escherichia coli)中，ymdB突變可介導(dǎo)sucA的下調(diào)表達(dá)，進(jìn)一步導(dǎo)致生物被膜形成減少。在達(dá)旦提迪克氏菌(Dickeya dadantii)中，2個(gè)TCA循環(huán)基因fumA和sdhCDAB的突變則可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)狀二鳥苷酸(cyclic diguanosine monophosphate,c di-GMP)濃度降低，進(jìn)而增加Pel的產(chǎn)生。因此，本研究構(gòu)建香蕉細(xì)菌性軟腐病菌D.zeae MS1的Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變體庫并篩選毒力減弱的突變體，探索更多潛在的可影響D.zeae細(xì)菌毒力的調(diào)控機(jī)制；同時(shí)，通過鑒定Tn5轉(zhuǎn)座子插入的基因位點(diǎn)、構(gòu)建被插入基因的敲除突變體與回補(bǔ)菌株等方法，研究基因敲除突變后細(xì)菌生長代謝、PCWDEs分泌和相關(guān)基因表達(dá)及細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性等方面產(chǎn)生的變化，明確該基因?qū)τ贒.zeae細(xì)菌毒力的影響，以期為細(xì)菌性軟腐病菌致病機(jī)制提供新的見解。
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