1.4定向馴化
從YPD平板挑取生長較好的初代單菌落于YPD活化培養(yǎng)基中，在30℃、200 r/min下培養(yǎng)過夜，取1 mL的菌液4℃、5 000×g離心5 min收集細(xì)胞，用無菌水重懸，最終以初始OD600=0.2接種于抑制物濃度為0.2 g/L的馴化培養(yǎng)基中，在30℃、200 r/min下培養(yǎng)24?48 h，使得酵母細(xì)胞OD600值達(dá)到2.0?3.0左右(即進(jìn)入穩(wěn)定期)，重復(fù)上述步驟2?3次，直至酵母細(xì)胞在當(dāng)前濃度的抑制物脅迫下生長速度顯著提高；接著，以相同的初始OD600值再次接種至抑制物濃度為0.4 g/L的馴化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定期，在此濃度下重復(fù)培養(yǎng)2?3次，以此類推，直至完成所有濃度批次的馴化。馴化結(jié)束后取菌液劃線YPD平板培養(yǎng)，挑取生長良好的單菌落作為最終的進(jìn)化菌株,接種至YPD活化培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12?16 h備用，并甘油保存于?80℃。不同抑制物的濃度都是以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 g/L梯度提高。
1.5進(jìn)化菌株抑制脅迫下的生長
取進(jìn)化菌株的活化液劃線平板培養(yǎng)，挑取單菌落于適量無菌ddH2O中，使各個菌液的OD600保持一致，并將重懸的細(xì)胞稀釋4個梯度(1、10、100、1 000倍)，分別吸取4μL對應(yīng)的菌液點樣于添加了不同濃度抑制物的檢測平板上，30℃倒置培養(yǎng)2?3 d，觀察細(xì)胞生長情況并拍照保存。
1.6進(jìn)化菌株的發(fā)酵性能監(jiān)測
取進(jìn)化菌株活化液，接種在含有50 mL的150 mL錐形瓶中，30℃、200 r/min培養(yǎng)12?16 h作為發(fā)酵種子液。取2.5 mL種子液以相同的OD600值接種至含有不同濃度抑制物的YPD發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min下振蕩培養(yǎng)3?4 d，每隔一段時間取樣測定葡萄糖、糠醛、對羥基苯甲酸、乙醇等物質(zhì)的含量。
1.7樣品分析
菌株生長量用紫外分光光度計檢測，取不同時間段的發(fā)酵液于600 nm吸收波長下讀取OD值。發(fā)酵液中的各物質(zhì)含量測定用高效液相色譜法，其中葡萄糖和乙醇含量的檢測用醇柱，柱溫50℃，流速0.5 mL/min，流動相為5 mmol/L的硫酸溶液。
1.8基因組重測序
分別挑取出發(fā)菌株W303-1A和不同抑制物下馴化完成的單菌落于YPD液體培養(yǎng)基中，在30℃、200 r/min下培養(yǎng)24?48 h，待細(xì)胞生長至穩(wěn)定期后，收集菌液，液氮快速冷卻后，置?80℃存放待測。
重測序工作由生工生物工程(上海)股份有限公司利用Illumina測序平臺完成。Illumina MiSeqTM得出的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識別(base calling)分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列(sequenced reads)。此外，對原始數(shù)據(jù)質(zhì)量值等信息進(jìn)行統(tǒng)計，并使用FastQC對樣本的測序數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行可視化評估。
2結(jié)果與討論
2.1 W303-1A的定向馴化
以適合實驗室研究的營養(yǎng)缺陷型單倍體菌株W303-1A作為出發(fā)菌株，分別以糠醛、對羥基苯甲酸以及糠醛+對羥基苯甲酸作為脅迫條件對其進(jìn)行定向馴化，主要過程如圖1所示。經(jīng)過50 d的培養(yǎng)后涂布于含有2.0 g/L抑制物的YPD平板，將平板倒置于37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24?48 h分離單克隆。篩選得到糠醛抗性提高的5株菌，分別命名為F-1、F-2、F-3、F-4、F-5，對羥基苯甲酸抗性提高的菌株5株，分別命名為A-1、A-2、A-3、A-4、A-5，以及糠醛+對羥基苯甲酸抗性提高的菌株5株，分別命名為B-1、B-2、B-3、B-4、B-5。
圖1酵母抗抑制物馴化過程示意圖
2.2抑制物脅迫下原始菌株和馴化菌株的平板生長情況
為了測試釀酒酵母W303-1A中經(jīng)過一段時間馴化后是否能促進(jìn)糠醛和對羥基苯甲酸脅迫下的生長性能，比較了經(jīng)糠醛馴化后生長較好的5株菌(即F-1、F-2、F-3、F-4、F-5)和對照菌株(W303-1A)在含有不同糠醛濃度培養(yǎng)基中的有氧生長活性(圖2A)。馴化后5株菌在糠醛為0.8 g/L的YPD板上能夠較好地生長，而原始菌株在0.8 g/L糠醛的YPD培養(yǎng)基上生長相對較弱。原始菌株在1.2 g/L糠醛的YPD培養(yǎng)基上也能夠存活，但生長速度遠(yuǎn)慢于馴化后的菌株。馴化后的5株菌在含有1.6 g/L糠醛的YPD的培養(yǎng)基中也可以較好地生長，而未經(jīng)馴化的原始菌株則無法生長。當(dāng)培養(yǎng)基中糠醛的濃度提升至2.0 g/L時，馴化的菌株中F-2的生長速度明顯高于其他4株馴化菌株，以上結(jié)果表明，馴化后的菌株對糠醛產(chǎn)生了一定的耐受性，其中，F(xiàn)-2菌株的耐受性最好。
圖2不同濃度的糠醛(A)、對羥基苯甲酸(B)和糠醛+對羥基苯甲酸(C)抑制脅迫下原始菌株和馴化菌株的平板生長情況
此外，本研究測試了經(jīng)對羥基苯甲酸梯度馴化后的菌株耐受性。如圖2B所示，挑取生長狀態(tài)較好的5株馴化后菌株在含有0.8、1.2、1.6、2.0 g/L對羥基苯甲酸濃度的YPD培養(yǎng)基上生長，并評估菌落的生長情況。與原始菌株W303-1A相比，馴化后酵母菌株并無明顯生長優(yōu)勢。此外，隨著對羥基苯甲酸濃度的增加，馴化后的5株酵母細(xì)胞的生長情況與原始菌株W303-1A相似且均可以很好地生長。其中，馴化后的菌株在2.0 g/L對羥基苯甲酸條件下的生長優(yōu)于對照菌株，這些結(jié)果表明，定向馴化能夠一定程度上提升菌株在對羥基苯甲酸脅迫條件下的生長性能。
為了評估糠醛和對羥基苯甲酸的協(xié)同抑制對馴化菌株的毒性，測定了不同濃度糠醛和對羥基苯甲酸(0.8、1.2、1.6、2.0 g/L)的YPD平板上菌株的生長速度。圖2C顯示了原始菌株以及馴化后菌株的生長情況，對于馴化后的菌株，在0.8 g/L和1.2 g/L的抑制物濃度下未觀察到生長抑制現(xiàn)象。隨著抑制物濃度的增加，5株經(jīng)馴化后的菌株細(xì)胞生長均受到明顯的生長抑制，在1.6 g/L的濃度時，原始菌株已無法正常適應(yīng)當(dāng)前的環(huán)境，此外，馴化的菌株生長也受到了一定的抑制。尤其是在濃度2.0 g/L時，幾乎所有的菌株均不能在培養(yǎng)基中生長。在添加0.8–1.6 g/L糠醛和對羥基苯甲酸的條件下，B-2的生長速度始終高于其他4株馴化菌株，以上結(jié)果表明，馴化后的菌株對抑制物協(xié)同作用的環(huán)境產(chǎn)生了一定的耐受性，其中，B-2菌株的耐受性最好。
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