2常見抑制因子對Anammox菌脫氮性能的影響及其作用機制
通過工藝運行參數(shù)的優(yōu)化可以為微生物創(chuàng)造適宜的生長環(huán)境，但運行參數(shù)的優(yōu)化只是為富集Anammox菌提供了必要的環(huán)境基礎(chǔ)，厭氧氨氧化（Anammox）工藝的長期穩(wěn)定運行仍然受到不可控因素（如鹽抑制及有毒物質(zhì)）的影響。常規(guī)有機物、鹽濃度和重金屬離子通常會對Anammox系統(tǒng)的穩(wěn)定運行產(chǎn)生不利影響。
2.1常規(guī)有機物
在城市生活污水中COD一般在180~500 mg/L范圍內(nèi)，其中可生物降解的COD占污水中總COD的30%~50%，但在高氨氮工業(yè)廢水中COD通常高達500~1 800 mg/L（即C/N=0.5~3）。廢水中含有不同種類和濃度的有機物，通常被認為會對Anammox菌產(chǎn)生負面影響。研究指出高濃度的有機物降低了Anammox菌的競爭優(yōu)勢，污泥胞外聚合物的產(chǎn)量明顯降低，導(dǎo)致Anammox污泥的容積指數(shù)升高和沉降性能變差。近年來，研究人員圍繞外源有機物對Anammox系統(tǒng)脫氮性能的影響開展了廣泛的研究，研究指出低質(zhì)量濃度（<50 mg/L COD）的有機物可以促使Anammox菌和異養(yǎng)反硝化細菌之間形成穩(wěn)定的協(xié)同作用，并不會導(dǎo)致反應(yīng)器脫氮性能出現(xiàn)明顯的降低。此外，醇類、醛類和酚類等毒害有機物也可以對Anammox菌產(chǎn)生抑制作用，其中酚類有機物的抑制作用是可逆的，而醇類有機物的毒性較強，且大多數(shù)抑制是不可逆的。研究表明Anammox菌體內(nèi)的羥胺氧化還原酶可以氧化甲醇生成甲醛，而甲醛可以通過與多肽的不可逆交聯(lián)引起蛋白質(zhì)的損傷，從而導(dǎo)致Anammox菌活性降低。含酚廢水中主要包含苯酚、硝基苯酚和氯酚等毒害污染物。研究表明苯酚質(zhì)量濃度為404 mg/L時，Ca.Kuenenia stuttgartiensis的活性在18 h內(nèi)下降了56%，而隨著反應(yīng)時間的延長（7 d），其活性僅下降了26%，而且去除反應(yīng)體系中的苯酚后該類抑制情況可以得到明顯緩解。研究指出進入Anammox菌體內(nèi)的苯酚可以和聯(lián)氨合成酶的α和γ亞基結(jié)合，且其可以競爭血紅素的活性位點，導(dǎo)致血紅素部分失活，阻斷了Anammox菌體內(nèi)聯(lián)氨的合成反應(yīng)，從而抑制了Anammox菌的代謝活性。此外，如果培養(yǎng)系統(tǒng)中長期存在苯酚，則苯酚將會逐漸滲透至細胞表面，在跨膜氨轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)之間形成氫鍵、疏水相互作用力和π-π鍵的疊加力，干擾NH4+的轉(zhuǎn)運，進而影響Anammox菌的活性。
Anammox菌最初被認為是專性化能自養(yǎng)微生物，但研究證實Anammox菌能夠通過異化硝酸鹽還原為氨（DNRA）途徑進行混合營養(yǎng)生長。Ca.Loosdrechtia aerotolerans的基因組中編碼了鐵氧化還原蛋白依賴型的硝酸鹽還原酶（NarB），其存在于多種微生物體內(nèi)，被認為是參與硝酸鹽還原的關(guān)鍵酶。NarB的存在可使Ca.Loosdrechtia aerotolerans有能力利用環(huán)境中的硝酸鹽作為電子受體氧化小分子有機物，使其在富含硝酸鹽的環(huán)境中獲得競爭優(yōu)勢。與此同時，Anammox菌除了化能自養(yǎng)外，還有一種可選擇的營養(yǎng)方式，即有機營養(yǎng)型。研究報道Ca.Jettenia asiatica能夠代謝乙酸和丙酸，并且生長效率比無機底物培養(yǎng)的生長效率高出10倍。此外，Ca.Loosdrechtia aerotolerans的基因組中也構(gòu)建出完整的丙酸鹽代謝途徑，從基因組層面證明了Anammox菌具有氧化小分子有機物的代謝潛能。在Anammox菌中，參與異化硝酸鹽還原為氨途徑的酶和氧化小分子有機物的代謝潛能表明Anammox菌在自然和工程生態(tài)系統(tǒng)中的生態(tài)位比傳統(tǒng)認知更為廣泛。與此同時，在實際廢水處理過程中高濃度的有機物不可避免地會對Anammox菌產(chǎn)生負面影響。近年來，有研究指出介體材料（如生物炭）可以有效緩解有機物對Anammox菌的抑制作用。
此外，內(nèi)源有機物對Anammox菌群的影響也值得進一步探究，內(nèi)源有機物主要來源于微生物的代謝活動，其主要的產(chǎn)生形式為胞外聚合物和可溶性微生物產(chǎn)物。胞外聚合物是Anammox顆粒污泥或生物膜的重要成分，影響著顆粒污泥或生物膜的傳質(zhì)效率、吸附能力、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。可溶性微生物產(chǎn)物則主要介導(dǎo)了Anammox菌與共存微生物之間的互作代謝過程。在顆粒污泥或生物膜系統(tǒng)中Anammox菌的生長速率取決于孔隙水中基質(zhì)的傳質(zhì)速率，胞外聚合物作為生物膜與液體環(huán)境之間潛在的離子傳輸通道，過多的胞外聚合物會占用基質(zhì)的傳輸通道，不利于反應(yīng)基質(zhì)的高效傳輸。此外，反應(yīng)器內(nèi)較高的氮負荷也會導(dǎo)致顆粒污泥分泌過量的胞外聚合物，導(dǎo)致污泥的沉降性和顆粒的懸浮性降低，主要原因在于較高的胞外聚合物含量可能致使顆粒污泥傳輸?shù)獨夂突|(zhì)的孔隙度降低。內(nèi)源有機物的另一種主要形式為可溶性微生物產(chǎn)物，其由可生物降解的有機物（如多糖和蛋白質(zhì)）、信號分子（如?；呓z氨酸內(nèi)酯類化合物）及次級代謝物（如維生素B12）組成。研究指出在缺乏外源有機物的情況下，可生物降解的可溶性微生物產(chǎn)物是發(fā)酵細菌和異養(yǎng)反硝化細菌的主要碳源，特別是氨基酸、維生素B12和?；呓z氨酸內(nèi)酯類化合物可能介導(dǎo)了Anammox菌和異養(yǎng)細菌之間的互營代謝過程。
2.2鹽濃度
高氨氮工業(yè)廢水通常具有高鹽的水質(zhì)特性，高鹽度會破壞細胞壁和抑制酶活性，甚至導(dǎo)致細胞的裂解。與此同時，鹽度的增加也會導(dǎo)致顆粒污泥尺寸和污泥聚集指數(shù)降低。污泥表面自由能分析結(jié)果表明，鹽度降低了污泥的Zeta電位和疏水性，增加了污泥的排斥勢壘，且隨著鹽度增加，胞外聚合物中表面親水官能團增加，氫鍵比例降低，蛋白質(zhì)二級疏水結(jié)構(gòu)減少，不利于污泥的聚集。此外，鹽度也是影響細菌活性的重要環(huán)境因素之一，不同類型的Anammox菌對鹽度的耐受程度不同。Ca.Scalindua spp.只有在Na（Ⅰ）質(zhì)量濃度高于0.046 g/L時才能進行Anammox反應(yīng)，且基質(zhì)消耗速率受到Na（Ⅰ）和K（Ⅰ）濃度的共同影響，而Ca.Kuenenia stuttgartiensis對鹽度的耐受極限為3~11.7 g/L NaCl，但Ca.Brocadia sinica對鹽度的耐受極限卻高達30 g/L NaCl。面對廢水中存在的復(fù)雜鹽成分，除了鹽度會導(dǎo)致滲透脅迫外，不同類型的鹽對于Anammox菌的抑制也存在差別。研究報道NaCl、KCl對Anammox菌的半抑制質(zhì)量濃度（IC50）分別為6.20 g/L和7.15 g/L。相較于NaCl，Anammox菌中亞硝酸鹽還原酶和聯(lián)氨合成酶更容易受到K（Ⅰ）的抑制而不是Na（Ⅰ）的抑制。
胞外聚合物作為細菌抵御環(huán)境干擾的第一道屏障，鹽度的增加可能導(dǎo)致細菌胞外聚合物的產(chǎn)量及離子含量發(fā)生變化。高鹽度（>15 g/L NaCl）可以刺激Anammox菌產(chǎn)生大量的胞外聚合物抵御鹽脅迫，雖然酶活性更容易受到K（Ⅰ）的抑制，但Anammox菌往往通過大量泵入K（Ⅰ）至細胞內(nèi)以防止離子梯度和細胞滲透壓的增加。此外，Anammox菌經(jīng)過長期馴化可以從低耐鹽性物種轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣望}性物種，其中通過合成或轉(zhuǎn)運相容性物質(zhì)或攝入鹽分的方式是Anammox菌適應(yīng)鹽度變化的主要機制。研究表明酵母菌提取物可以提高Ca.Scalindua japonica的活性，其可以通過直接吸取酵母菌的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)或滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的前體物來維持細胞的滲透壓平衡，而且Ca.Scalindua japonica還可以直接吸取胞外相容性物質(zhì)或相容性物質(zhì)的前體物，以節(jié)省合成或轉(zhuǎn)運相容性物質(zhì)消耗的能量，而Ca.Scalindua rubra則可以合成相容性物質(zhì)或攝入鹽分兩種途徑來適應(yīng)鹽度變化。面對鹽脅迫下出現(xiàn)不斷惡化的水質(zhì)狀況，除了微生物自身合成的相容性物質(zhì)，一些溶解性外源添加物也能增強Anammox系統(tǒng)抵御不利環(huán)境的能力。研究報道35.14 mg/L甘氨酸甜菜堿（GB）和54.65 mg/L甘露醇（MA）均能緩解Anammox過程中的鹽脅迫（20 g/L NaCl），添加GB和MA后13 d內(nèi)系統(tǒng)的脫氮效率分別從40%恢復(fù)到80.9%和69.1%，且Anammox菌的相對豐度分別增加了7.1%和4.3%。此外，低濃度的溶解氧和Fe（Ⅲ）也被證實可以增強Anammox菌的關(guān)鍵酶合成，促進Anammox菌的能量代謝，減輕鹽脅迫對Anammox菌的影響。
2.3重金屬離子
重金屬離子對Anammox菌的影響主要分為短期和長期毒性抑制，其中短期毒性抑制側(cè)重于評價重金屬離子的急性毒性，而長期毒性抑制則重點關(guān)注Anammox菌對重金屬離子的環(huán)境適應(yīng)性和恢復(fù)能力。對于短期毒性抑制而言，不同濃度的重金屬離子對Anammox菌的影響具有顯著差異。低濃度的重金屬離子可以刺激Anammox菌分泌大量的胞外聚合物抵御脅迫，當Cu（Ⅱ）質(zhì)量濃度為5 mg/L時，重金屬離子傾向于與胞外聚合物中帶負電荷的官能團結(jié)合，降低靜電斥力，形成橋接效應(yīng)，使得污泥處于致密狀態(tài)，但當Cu（Ⅱ）質(zhì)量濃度升高至10~50 mg/L時，重金屬離子傾向于與蛋白質(zhì)中的羧基結(jié)合，導(dǎo)致胞外聚合物中蛋白質(zhì)的鏈狀結(jié)構(gòu)被破壞，使得污泥處于松散狀態(tài)。高濃度的重金屬離子通常會對Anammox系統(tǒng)產(chǎn)生更強的急性毒性抑制。研究表明高濃度的重金屬離子通?？梢詮目扇苄晕⑸锂a(chǎn)物轉(zhuǎn)移至胞外聚合物，進而擴散至細胞膜表面。胞外聚合物中的蛋白質(zhì)為金屬離子提供了大量的結(jié)合位點和官能團（如甲基、氨基、羧基和羥基等）8，6。金屬離子與蛋白質(zhì)上的官能團結(jié)合后，經(jīng)過非特異性濃度梯度擴散至細胞內(nèi)，與細胞內(nèi)的核酸和酶活性位點結(jié)合，從而破壞細胞的結(jié)構(gòu)和功能。例如，擴散至細胞表面的Zn（Ⅱ）通常會刺激細胞產(chǎn)生活性氧等自由基，造成DNA損傷和脂質(zhì)氧化分解，進而導(dǎo)致細胞膜的解離圖2（a）。此外，Cu（Ⅱ）也可以刺激細胞生成羥基自由基，在氧化還原過程中產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)。與此同時，Anammox菌群通常具有緩解重金屬離子生物毒性的能力，Ca.Kuenenia stuttgartiensis可以通過基質(zhì)降解、Zn（Ⅱ）外排、絡(luò)合反應(yīng)、蛋白質(zhì)降解與合成、DNA修復(fù)以及信號傳導(dǎo)等方式抵御脅迫。然而，Anammox菌在適應(yīng)重金屬離子的應(yīng)激過程中，細胞產(chǎn)生的大部分能量被用于去除細胞內(nèi)多余的金屬離子，降低了用于Anammox反應(yīng)的能量供應(yīng)，從而導(dǎo)致反應(yīng)器的脫氮性能下降。
圖2重金屬離子對Anammox菌的影響
對于長期毒性抑制而言，重金屬離子對Anammox菌的影響通常超過20 d，其中Anammox菌的競爭優(yōu)勢降低，金屬離子傳輸系統(tǒng)的抑制和胞外聚合物留存的過量重金屬離子是導(dǎo)致Anammox系統(tǒng)持續(xù)中毒的主要原因。例如，在高濃度銅離子的沖擊下，負責(zé)將Cu（Ⅱ）從Anammox菌細胞內(nèi)泵送到細胞外的基因cusA的表達明顯降低，使得Anammox菌細胞內(nèi)Cu（Ⅱ）濃度進一步升高，導(dǎo)致Anammox系統(tǒng)出現(xiàn)長達50 d的抑制現(xiàn)象。此外，胞外聚合物吸附的重金屬離子仍能持續(xù)向周圍環(huán)境釋放，從而長期抑制微生物的活性。廢水中影響Anammox過程的重金屬離子較多，其中包括Cu（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）、Fe（Ⅲ）、Cd（Ⅱ）、Pb（Ⅱ）、Cr（Ⅲ）、Ni（Ⅱ）、Ag（Ⅰ）、Mn（Ⅱ）和Hg（Ⅱ）等，其中Hg（Ⅱ）和Cd（Ⅱ）對Anammox菌的毒性具有持久性，而Cu（Ⅱ）和Zn（Ⅱ）對Anammox菌的毒性具有可逆性。在重金屬離子的脅迫下，可能促進負責(zé)物質(zhì)遷移轉(zhuǎn)化的功能基因表達增加，不僅可以將毒性較高的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為低毒物質(zhì)，還可以將細胞內(nèi)過量的重金屬離子排出體外，這種自我調(diào)節(jié)的解毒過程有助于Anammox系統(tǒng)恢復(fù)其生物活性。其中，As（Ⅲ）可以在微生物的作用下發(fā)生價態(tài)轉(zhuǎn)換被氧化成低毒性的As（Ⅴ），降低了重金屬離子的生物毒性。此外，Cr（Ⅳ）和Cr（Ⅵ）也能在微生物的作用下還原為Cr（Ⅲ），但在長期的Cr（Ⅵ）暴露下，細胞內(nèi)富集的Cr（Ⅵ）將破壞酶的結(jié)構(gòu)，阻斷功能基因的表達，導(dǎo)致反應(yīng)器的脫氮性能顯著降低。與此同時，研究指出一些低濃度的重金屬離子可以用于提高Anammox菌的活性。例如，Anammox菌可以利用Fe（Ⅲ）和Mn（Ⅱ）作為潛在的電子受體強化Anammox菌群的胞外電子傳遞過程，提高Anammox系統(tǒng)的脫氮性能。
重金屬離子的毒性水平、系統(tǒng)的恢復(fù)時間及微生物的適應(yīng)性可以用于判斷重金屬離子的毒性強弱圖2（b）。其中，Hg（Ⅱ）、Cu（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）、Cd（Ⅱ）被認為是高毒性的重金屬離子，這些重金屬離子通?？梢灾苯踊蛲ㄟ^價態(tài)轉(zhuǎn)變產(chǎn)生自由基，攻擊細胞中的蛋白質(zhì)和DNA，阻止微生物的電子轉(zhuǎn)移，使Anammox菌難以對這些重金屬離子產(chǎn)生抗性，并且在質(zhì)量濃度為10 mg/L時即可抑制50%的Anammox活性，同時需要大約30 d的時間才能恢復(fù)活性。此外，F(xiàn)e（Ⅲ）、Mn（Ⅱ）、Ni（Ⅱ）和Ag（Ⅰ）被認為是中毒性的重金屬離子。相較于高毒性的重金屬離子，F(xiàn)e（Ⅲ）、Mn（Ⅱ）、Ni（Ⅱ）和Ag（Ⅰ）對Anammox菌的抑制作用較小，可以在15 d左右恢復(fù)活性。Pb（Ⅱ）、Mo（Ⅳ）和As（Ⅲ）對Anammox菌的毒性較弱，被認為是低毒性的重金屬離子。值得注意的是，一些重金屬離子通常以沉淀的形式存在于Anammox系統(tǒng)中，因此其實際毒性可能明顯低于理論結(jié)果。例如，Pb（Ⅱ）對Anammox菌毒性較弱的原因可能與其在環(huán)境介質(zhì)中的溶解度較低有關(guān)。在Anammox菌的培養(yǎng)馴化過程中通常利用碳酸氫鹽調(diào)控廢水的堿度，這導(dǎo)致Pb（Ⅱ）往往以沉淀的形式存在于反應(yīng)體系。研究表明即使在Anammox反應(yīng)器內(nèi)添加了40 mg/L的Pb（Ⅱ），但其液體離子質(zhì)量濃度僅為2.3 mg/L，這極大地限制了Pb（Ⅱ）在Anammox系統(tǒng)的毒性作用。為了緩解重金屬及其離子對Anammox菌的抑制，研究人員采用多種手段調(diào)控提升Anammox菌抵抗不利環(huán)境的能力圖2（a）。例如，嚴格控制微生物周圍環(huán)境的pH，減少重金屬離子與Anammox菌表面的弱酸性有機官能團結(jié)合；調(diào)控重金屬離子與環(huán)境中的有機物或無機物絡(luò)合沉淀，并以微溶金屬鹽的形式析出；利用低強度超聲結(jié)合EDTA清洗，提高Anammox菌對重金屬離子的抵抗能力；馴化具有較高生物量的顆粒污泥或生物膜，增強Anammox菌對重金屬離子的抗性。
3總結(jié)和展望
面對廢水中復(fù)雜的水質(zhì)特性和污染物種類，pH對微生物生長和代謝的直接影響以及pH變化帶來的游離氨和游離亞硝酸鹽的毒性抑制不容忽視，而針對低溫對Anammox菌活性的抑制，冷休克蛋白可以在一定程度上消除低溫對Anammox菌的負面影響。此外，Anammox菌是耐氧菌而不是嚴格的厭氧菌，不同的Anammox菌具有多種策略耐受自然和工程生態(tài)系統(tǒng)中的氧氣，顆粒污泥或生物膜形式的載體有利于避免Anammox菌受到溶解氧的抑制。低濃度的外源有機物有助于Anammox菌與異養(yǎng)菌形成穩(wěn)定的協(xié)同作用，且Anammox菌除了化能自養(yǎng)外，其還具有氧化小分子有機物的代謝潛能，微生物分泌的外源有機物可以介導(dǎo)Anammox菌和異養(yǎng)細菌之間的互營代謝過程。對于廢水中存在的鹽脅迫，Anammox菌合成或轉(zhuǎn)運相容性物質(zhì)或攝入鹽分是其適應(yīng)鹽度變化的主要機制，低濃度的溶解氧和Fe（Ⅲ）也可以緩解鹽脅迫對Anammox菌的影響。根據(jù)重金屬離子對Anammox菌的毒性，Hg（Ⅱ）、Cu（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）、Cd（Ⅱ）被認為是高毒性的重金屬離子，F(xiàn)e（Ⅲ）、Mn（Ⅱ）、Ni（Ⅱ）和Ag（Ⅰ）被認為是中毒性的重金屬離子，而Pb（Ⅱ）、Mo（Ⅳ）和As（Ⅲ）則被認為是低毒性的金屬離子。作為一種低碳的新型廢水生物脫氮工藝，Anammox具有較強的應(yīng)用潛力，目前的研究已經(jīng)深入探討了各種抑制因子的作用機制，但在實驗室條件下的毒性評價方法具有局限性，未來可從以下方面深入研究：1）從細胞結(jié)構(gòu)水平探究Anammox菌的中毒機制及生物適應(yīng)性，評價多種抑制因子共存的毒性抑制效果，建立適合工程應(yīng)用的毒性評價方法；2）開展不同類型實際廢水抑制因子對Anammox菌的短期、長期及復(fù)合影響。
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