2結(jié)果
2.1細(xì)胞病變
接毒12 h后即可觀察到CPE，在48 h時(shí)最明顯，主要細(xì)胞病變?yōu)榧?xì)胞萎縮、破碎，脫落，成團(tuán)，邊緣不清晰，個(gè)別胞體出現(xiàn)變大，死亡等特征，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好(圖1)。
A.正常；B.接毒后24 h；C.接毒后48 h；D.接毒后72 h
圖1 DF1細(xì)胞形態(tài)(400×)
2.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
收取接種ARV S1133株的第3代DF1細(xì)胞培養(yǎng)物，用RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果擴(kuò)增到一條1 248 bp大小片段(圖2)。對(duì)片段序列與所選的參考株同源性在99.99%以上，說明ARV S1133毒株在DF1細(xì)胞上增殖。
2.3 ARV S1133毒株在DF1細(xì)胞系上的增殖規(guī)律
ARV S1133接種DF1細(xì)胞后，分別收取12、24、36、48、72、96、120 h的細(xì)胞培養(yǎng)物，測(cè)其TCID50，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別做3次重復(fù)試驗(yàn)，取平均值。7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的TCID50平均值分別為10-2.49、10-3.5、10-6.84、10-8.9、10-7.86、10-5.38、10-3.64，繪制出生長(zhǎng)曲線(圖3)。該曲線顯示，ARV接種DF1細(xì)胞后，0～12 h為靜止期，12 h～48 h為快速增長(zhǎng)期，在48 h達(dá)到最大的病毒效價(jià)，TCID50為10-8.9/0.1 mL。
M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2.陰性對(duì)照
圖2 ARV RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
圖3 ARV S1133在DF1細(xì)胞上的生長(zhǎng)曲線
3討論
隨著養(yǎng)禽業(yè)的快速發(fā)展，禽病發(fā)生日益增多。近年來，多省份陸續(xù)有ARV感染疫情的發(fā)生，報(bào)道指出ARV有更廣的宿主范圍，更強(qiáng)的致病性，流行的疫區(qū)也日漸擴(kuò)大，是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的重要傳染病。目前，分離ARV一般采用雞胚接種，此法雖然單次獲毒較多，但需要的時(shí)間長(zhǎng)，且操作繁瑣，在快速獲取大量病毒方面不具有時(shí)效性，在一定程度上反而限制了ARV的分離。DF1細(xì)胞系來源于ELL雞胚胎，該細(xì)胞無禽白血病病毒、肉瘤病毒內(nèi)源性基因，同時(shí)在形態(tài)上呈纖維狀，是一種穩(wěn)定的、無腫瘤基因、自發(fā)無限增殖的細(xì)胞系。目前被廣泛用于動(dòng)物病毒研究、疫苗研制、癌癥研究等諸多領(lǐng)域，是生命科學(xué)領(lǐng)域重要的病毒轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)生物材料。ARV基因組為RNA，而DF1細(xì)胞可用于反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制，DF1細(xì)胞系有助于ARV對(duì)細(xì)胞殺傷力的研究。為此，采用了細(xì)胞增殖病毒的方法，研究了ARV S1133毒株在DF1細(xì)胞上的增殖特性，大大縮短了獲取大量病毒的時(shí)間，大幅提高了獲毒效率。
定量描述病毒生長(zhǎng)規(guī)律的實(shí)驗(yàn)曲線稱為一步生長(zhǎng)曲線，根據(jù)病毒的生長(zhǎng)特點(diǎn)可劃分為靜止期、快速增長(zhǎng)期、穩(wěn)定期3個(gè)時(shí)期。通常用來研究病毒在細(xì)胞上的增殖規(guī)律的方法主要有測(cè)定病毒的TCID50和病毒蝕斑試驗(yàn)。本研究直接采取了測(cè)定病毒TCID50的方法，并用PCR檢測(cè)、測(cè)序確定細(xì)胞僅有ARV感染，無其他病原污染。試驗(yàn)結(jié)果顯示，ARV接種DF1細(xì)胞后，前24 h為靜止期，24 h后進(jìn)入快速增長(zhǎng)期，并在48 h達(dá)到最大的病毒效價(jià)，即TCID50為10-8.9/0.1 mL。這一增殖規(guī)律可能與細(xì)胞的自身免疫機(jī)制有關(guān)，至于真正的原因，還待進(jìn)一步的研究。本研究結(jié)果表明，ARV可在DF1細(xì)胞上有效地增殖，并伴有典型病變，在接毒48 h后出現(xiàn)病毒效價(jià)峰值，TCID50為10-8.9/0.1 mL。ARV感染DF1細(xì)胞的最佳收毒時(shí)間為接毒后的48 h。本研究結(jié)果可為下一步用DF1細(xì)胞研制ARV滅活苗及致病機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。
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