2結(jié)果
2.1綠膿桿菌噬菌體的分離與純化
通過雙層平板法分離得到一株噬菌體,命名為phage30。純化3代后,得到單一均勻圓形、清晰透明,邊緣光滑,直徑為1～2 mm的噬菌斑(圖1)。測(cè)得其效價(jià)為4.3×1010PFU/mL。
圖1噬菌體phage30的噬菌斑形態(tài)
2.2噬菌體的電鏡觀察透射電鏡觀察
phage30,由明顯的頭部和尾部構(gòu)成。頭部呈正二十面體,直徑約60 nm,尾部長(zhǎng)約180 nm,不可伸縮(圖2)。按照國(guó)際病毒分類委員會(huì)分類標(biāo)準(zhǔn),屬于有尾噬菌體目,長(zhǎng)尾噬菌體科。
圖2噬菌體phage30的電鏡形態(tài)
2.3噬菌體裂解譜的測(cè)定
點(diǎn)樣法測(cè)定噬菌體phage30的裂解譜,結(jié)果表明,27株綠膿桿菌中噬菌體phage30能夠裂解8株綠膿桿菌,裂解率為29.63%(8/27)。
2.4噬菌體敏感性的測(cè)定
2.4.1噬菌體phage30的pH值穩(wěn)定性測(cè)定試驗(yàn)測(cè)定得到的phage30的pH值穩(wěn)定性曲線,見圖3。由圖3可知,當(dāng)pH值為5～11時(shí),噬菌體phage30效價(jià)基本保持不變；當(dāng)pH值＜5或pH值＞11時(shí),噬菌體phage30的裂解活性迅速下降。另外,噬菌體phage30在同一pH值條件下作用時(shí)間對(duì)噬菌體的裂解活性影響不大。因此當(dāng)pH值為5～11時(shí),噬菌體活性穩(wěn)定。
圖3噬菌體phage30的pH值穩(wěn)定性
2.4.2噬菌體phage30熱穩(wěn)定性測(cè)定
試驗(yàn)測(cè)定得到的phage30的熱穩(wěn)定性曲線,見圖4。噬菌體phage30在40℃條件下,其效價(jià)基本保持不變,維持在1010以上；當(dāng)溫度高于50℃時(shí)隨著作用時(shí)間的增長(zhǎng),其效價(jià)明顯呈數(shù)量級(jí)下降,裂解活性迅速減弱甚至失活。因此,當(dāng)溫度在40℃以下的時(shí)候,噬菌體phage30活性保持較好。
圖4噬菌體phage30的熱穩(wěn)定性
2.5噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定
噬菌體phage30最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定結(jié)果見表1。由表1可知,當(dāng)MOI=0.01時(shí),噬菌體phage30的效價(jià)最高達(dá)到2.3×1010PFU/mL。根據(jù)結(jié)果計(jì)算噬菌體phage30的最佳感染復(fù)數(shù)為0.01。
2.6噬菌體一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
測(cè)定得到噬菌體phage30的一步生長(zhǎng)曲線見圖5。由圖5可知,噬菌體phage30的潛伏期約為60 min,爆發(fā)期約為120 min,裂解量約為156。
表1噬菌體phage30最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定
圖5一步生長(zhǎng)曲線
3討論
自然界中噬菌體的數(shù)量龐大可達(dá)1031,分布范圍廣。由于細(xì)菌耐藥性的廣泛存在,噬菌體作為細(xì)菌的天敵,具有作為抗生素替代品的開發(fā)潛力,近年來備受關(guān)注。
本研究成功篩選到1株綠膿桿菌噬菌體對(duì)其形態(tài)及生物學(xué)特征進(jìn)行了鑒定。電鏡形態(tài)觀察確定噬菌體phage30由二十面體的頭部和不可伸縮的尾部組成,屬于有尾噬菌體目,長(zhǎng)尾噬菌體科。噬菌體phage30的最佳感染復(fù)數(shù)為0.01,表明噬菌體phage30可以在較低濃度時(shí)有效裂解宿主菌,裂解性能高、殺菌效果好,這與徐彬等報(bào)道的銅綠假單胞菌噬菌體D204的最佳感染復(fù)數(shù)一致。不同的綠膿桿菌噬菌體其潛伏期、裂解量存在較大差異。郭棵棵等分離到的綠膿桿菌噬菌體PaP6的潛伏期為10 min,暴發(fā)期為50 min,裂解量為10；李亞輝等分離的綠膿桿菌噬菌體PL39的潛伏期為20 min,暴發(fā)期為5 min,裂解量為20。本試驗(yàn)分離到的綠膿桿菌噬菌體phage30潛伏期為60 min,暴發(fā)期為120 min,裂解量為156。噬菌體的裂解量與其基因組特征密切相關(guān)。噬菌體基因組中tRNAs數(shù)量越多,越有利于噬菌體蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯,進(jìn)而提高噬菌體的增殖效率,縮短潛伏期的時(shí)間。噬菌體phage30潛伏期較長(zhǎng),暴發(fā)期長(zhǎng),裂解量高的原因尚需做進(jìn)一步基因組測(cè)序分析。
噬菌體對(duì)溫度和pH值的耐受力是衡量噬菌體穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。本研究測(cè)定了噬菌體phage30對(duì)溫度和pH值的敏感性,發(fā)現(xiàn)其對(duì)溫度和pH值的耐受力都較強(qiáng),這對(duì)環(huán)境中溫度和pH值的不可掌控性來說是很好的應(yīng)對(duì)機(jī)制。水貂的最適養(yǎng)殖溫度在20℃～35℃,使用酸性或堿性消毒劑凈化貂舍可導(dǎo)致環(huán)境pH值發(fā)生變化。本次分離到的噬菌體phage30在pH值5～11、溫度40℃以下時(shí)其裂解活性基本保持不變,具有良好的環(huán)境適應(yīng)能力。
噬菌體phage30可專性裂解綠膿桿菌,具有宿主譜寬、裂解性能高、pH值和熱穩(wěn)定性好的特征,有潛在的開發(fā)價(jià)值應(yīng)用于綠膿桿菌病的防治。
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