1.2試驗(yàn)方法
1.2.1菌株初篩
取30 g舍飼基礎(chǔ)飼糧的肉雞糞便，加入帶有玻璃珠的150 mL滅菌蒸餾水的錐形瓶中，在轉(zhuǎn)速為200 r/min、溫度為30℃的搖床中培養(yǎng)30 min后，取5 mL菌懸液，接種于50 mL滅菌后的富集培養(yǎng)基中，在同上條件的搖床中培養(yǎng)48 h后，取5 mL富集培養(yǎng)液接入新的富集培養(yǎng)基中，如此反復(fù)連續(xù)富集3次。將富集培養(yǎng)后的菌液按梯度稀釋?zhuān)鶆蛲坎加赮PD固體培養(yǎng)基上，在30℃恒溫箱內(nèi)倒置恒溫培養(yǎng)24~48 h。挑取平板上具有不同菌落特征的疑似酵母菌落進(jìn)行重復(fù)劃線(xiàn)分離、純化處理，至所獲菌株的形態(tài)完全一致后，保藏備用。
1.2.2菌株復(fù)篩
將上述純化后的酵母菌分別接入YPD培養(yǎng)基中，活化培養(yǎng)24 h備用。分別吸取1 mL菌液置于無(wú)菌離心管中，在4℃、4 145×g條件下離心10 min后棄上清液，用無(wú)菌生理鹽水洗滌3次。最后用1 mL無(wú)菌生理鹽水重懸，制成菌懸液，接入裝有100 mL的篩選培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于30℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)48 h后，通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)基中氨氮含量、酵母菌的生物量、蛋白質(zhì)含量和總蛋白質(zhì)得率，分析不同酵母菌的氨氮轉(zhuǎn)化能力。取氨氮利用能力較高的菌株培養(yǎng)液10μL，接入裝有190μL液體YPD培養(yǎng)基的100孔板中，將100孔板放入Bioscreen C PRO型全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線(xiàn)分析儀中，以YPD液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，設(shè)置溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間48 h，檢測(cè)波長(zhǎng)為600 nm，檢測(cè)時(shí)間間隔為2 h。觀察各菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，最終篩選出生長(zhǎng)較快的疑似酵母菌。
1.2.3酵母菌的鑒定及生理生化特性
1.2.3.1菌落及菌體的形態(tài)學(xué)觀察
將疑似酵母菌劃線(xiàn)接種到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)72 h，觀察菌落形態(tài)。用接種環(huán)取適量菌體置于載玻片上，制成水浸片，在生物顯微鏡下觀察菌體的細(xì)胞形態(tài)。
1.2.3.2分子生物學(xué)鑒定
將疑似酵母菌Y-7在YPD瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)后，送至北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行分析鑒定。采用18S rDNA分子鑒定，試驗(yàn)所用引物為真菌通用引物:NS1(5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3')和NS8(5'-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3')。通過(guò)BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，搜尋同源序列，再用MEGA7.0軟件中鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
1.2.3.3生理生化試驗(yàn)
將分離純化好的菌株轉(zhuǎn)到BUY平板上，26℃培養(yǎng)48 h，制備菌懸液接種于YT微孔板，26℃培養(yǎng)72 h。分別在24、48和72 h，使用美國(guó)Biolog公司的MicrologTM 3軟件采集數(shù)據(jù)，并進(jìn)行生理生化特性分析。
1.2.4酵母菌抗逆性對(duì)比研究
1.2.4.1耐溫性
將釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母和酵母菌Y-7的種子液按2%的接種量接入已滅菌的YPD培養(yǎng)基中，分別在不同溫度(30、35、40、45和50℃)下靜止培養(yǎng)24 h后，取適量酵母菌液于波長(zhǎng)600 nm下測(cè)定吸光度值，重復(fù)3次，取平均值。
1.2.4.2耐酸性
將釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母和酵母菌Y-7的種子液按2%的接種量接入pH分別為1、2、3、4、5和6的YPD培養(yǎng)基中，于30℃靜止培養(yǎng)24 h后，取適量酵母菌液于波長(zhǎng)600 nm下測(cè)定吸光度值，重復(fù)3次，取平均值。
1.2.4.3耐鹽性
將釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母和酵母菌Y-7的種子液按2%的接種量接入NaCl濃度為5%、7%、9%、11%和13%的YPD培養(yǎng)基中，于30℃靜止培養(yǎng)24 h后，取適量酵母菌液于波長(zhǎng)600 nm下測(cè)定吸光度值，重復(fù)3次，取平均值。
1.3檢測(cè)指標(biāo)
菌體生物量的測(cè)定:取20 mL發(fā)酵液放入預(yù)稱(chēng)重的離心管中，在8 000×g條件下離心10 min，將離心得到的沉淀洗滌3次，并于65℃條件烘至恒重，稱(chēng)量并計(jì)算菌體生物量。
氨氮降解率的測(cè)定:采用苯酚-次氯酸鹽法測(cè)定上清液的氨氮含量，并計(jì)算氨氮降解率:
氨氮降解率(%)=[(初始氨氮含量-上清液氨氮含量)/初始氨氮含量]×100。
菌體蛋白質(zhì)含量的測(cè)定:將烘干的菌體粉碎后，采用中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《飼料中粗蛋白的測(cè)定凱氏定氮法(GB/T 6432—2018)》的方法測(cè)定菌體蛋白質(zhì)含量，并計(jì)算總蛋白質(zhì)得率:
總蛋白質(zhì)得率(g/L)=菌體生物量×菌體蛋白質(zhì)含量。
1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2021初步處理后，采用SPSS 26.0軟件中one-way ANOVA程序進(jìn)行方差分析，并用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05為差異顯著。采用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行繪圖。
2結(jié)果與分析
2.1酵母菌的篩選
從采集的雞糞中分離出16株疑似酵母菌，編號(hào)分別為Y-1~Y-16。如表1所示，對(duì)初篩菌株進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果共獲得7株氨氮降解率在30%以上的疑似酵母菌。其中，菌株Y-7的生物量、總蛋白質(zhì)得率和氨氮降解率均顯著高于其余6株菌(P<0.05)。菌株Y-6的蛋白質(zhì)含量顯著高于其余6株菌(P<0.05)。
表1篩選酵母菌對(duì)氨氮的利用能力
如圖1所示，對(duì)上述7株菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株Y-7生長(zhǎng)速度快于其余6株菌，0~2 h處于遲滯期，2~12 h處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，12 h后進(jìn)入平臺(tái)期。綜上所述，復(fù)篩出菌株Y-7進(jìn)行下一步形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定。
圖1篩選酵母菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)
2.2酵母菌的鑒定及生理生化特性
2.2.1菌落及菌體形態(tài)的觀察
如圖2-A所示，觀察菌株Y-7的菌落的形態(tài)特征，菌落呈圓形、白色、光滑、黏稠、邊緣整齊。如圖2-B所示，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察，細(xì)胞呈卵圓形、橢圓形，單個(gè)或雙個(gè)，大小(1.3~1.9)μm×(3.5~10)μm。
圖2菌落及菌體形態(tài)的觀察
2.2.2酵母菌的分子生物學(xué)鑒定
由圖3可知，菌株Y-7所測(cè)得的18S rDNA序列與已發(fā)表的假絲酵母菌屬(Candida)相近種模式菌的序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示菌株Y-7與克魯斯假絲酵母(Candida krusei)NRRL-Y-5396聚在同一分支，親緣關(guān)系最近，結(jié)合形態(tài)特征，確定菌株Y-7為克魯斯假絲酵母。
圖3基于18S rDNA基因序列菌株Y-7的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Candida:假絲酵母菌屬;Candida krusei:克魯斯假絲酵母;strain:菌株。
2.2.3酵母菌的生理生化特性
如表2所示，菌株Y-7可以代謝的碳源種類(lèi)有2種，包括N-乙?；?D-葡萄糖氨、α-D-葡萄糖;處于邊界值的1種(菊糖);不能代謝的有31種。此外，菌株Y-7能夠同化的碳源有3種，包括N-乙?；?D-葡萄糖氨、α-D-葡萄糖、琥珀酸單甲基酯和D-木糖/戊醛糖;處于邊界值的有3種，包括L-谷氨酸、甘油、D-木糖;不能同化的有53種。
表2菌株Y-7的碳源利用情況
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