2.2 hrcN基因打靶序列片段的構(gòu)建
突變體篩選的抗性基因采用Gm抗性基因（長度832 bp），hrcN基因上游同源重組臂和下游同源重組臂長度分別為799和742 bp，利用融合PCR技術(shù)構(gòu)建打靶序列片段（上游同源重組臂-Gm抗性基因編碼序列-下游同源重組臂），長度為2373 bp。圖3電泳圖顯示，泳道1中有4條帶，其中最亮的條帶為打靶序列片段，電泳結(jié)果表明成功構(gòu)建了打靶序列片段。
2.3 hrcN基因突變株的構(gòu)建
將供菌體和受菌體（CBM613菌株）混合結(jié)合后，抗性平板上培養(yǎng)單克隆，隨機挑選10個單克隆，用hrcN基因內(nèi)部引物進行PCR鑒定。如發(fā)生二次重組，則這對引物無擴增產(chǎn)物，否則有227 bp的特異性擴增條帶。圖4結(jié)果顯示：第1～6號克隆為陰性擴增，表明hrcN基因可能已被敲除；7～10號克隆有227 bp的特異性條帶，說明沒有發(fā)生二次重組，hrcN基因未能成功敲除。
將上述1號克隆再次進行hrcN基因內(nèi)部引物鑒定，為陰性擴增后用hrcN基因外側(cè)引物進行進一步的鑒定。圖5顯示，條帶2為原始菌株的擴增產(chǎn)物長度為2739 bp；條帶1為Gm抗性基因替換菌株的擴增產(chǎn)物長度為2580 bp，同時測序結(jié)果顯示局部序列同設(shè)計。該克隆子為最終的hrcN基因被Gm抗性基因替換的陽性克隆，稱為：CBM613/ΔhrcN。
2.4回補菌株的篩選及鑒定
在Tc平板上的陽性克隆用pRK415-F/pRK415-R載體引物對進行PCR鑒定。當(dāng)hrcN克隆入設(shè)計位點后，這對引物的擴增產(chǎn)物長度為1634 bp。圖6結(jié)果顯示，1～6號全部克隆都有預(yù)期長度的特異片段擴增，取第1號克隆的PCR產(chǎn)物進行測序，結(jié)果顯示與設(shè)計一致。經(jīng)轉(zhuǎn)化CBM613/ΔhrcN受體菌后，涂布篩選出陽性克隆，pRK415-F/pRK415-R引物進行PCR擴增，有預(yù)期長度的特異片段擴增，表明青枯雷爾氏菌突變株hrcN基因回補成功。
2.5 hrcN基因?qū)η嗫堇谞柺暇虏×Φ挠绊?
hrcN基因敲除后，在NA培養(yǎng)基上28℃生長5 d，突變株和回補菌株菌落形態(tài)與野生型菌株相比無明顯變化（圖7）。進一步將野生型菌株、hrcN基因突變株和回補菌株采用根部接種法接種番茄測定致病力結(jié)果表明，野生型菌株接種番茄植株后，在第4 d開始發(fā)病，突變株在第5 d才開始出現(xiàn)萎蔫癥狀。圖8為野生型菌株、突變株和回補菌株在接種后第7 d的發(fā)病情況可知，野生型菌株的病情指數(shù)為1.87，突變株僅為0.27，下降了85.56%；相比野生型菌株，回補菌株病情指數(shù)為1.67，突變株的致病力能夠部分恢復(fù)。接種12 d后，野生型菌株的病情指數(shù)高達3.49，而突變株僅為1.89，回補菌株有所恢復(fù)為3.18。接種試驗結(jié)果顯示：突變株較野生型菌株的致病力下降，病程延長，但并未喪失致病力，表明hrcN基因是青枯雷爾氏菌致病性相關(guān)的重要基因。
2.6 hrcN基因?qū)η嗫堇谞柺暇?a href="http://www.qzmj.cn/" target="_blank">生長曲線的影響
分別將CBM613菌株、CBM613/ΔhrcN突變株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回補菌株在Boucher基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基（貧營養(yǎng)培養(yǎng)基）和CPG培養(yǎng)基（富營養(yǎng)培養(yǎng)基）中進行生長曲線測定，野生型菌株、突變株和回補菌株在富營養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長速率差異不明顯（圖9）。
3種青枯雷爾氏菌在貧營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 h后，突變株比野生型菌株生長更快（圖10），生長速率開始出現(xiàn)明顯差異（P＜0.05），回補菌株與野生型菌株生長速率無明顯差異。
2.7 hrcN基因?qū)η嗫堇谞柺暇\動性的影響
利用半固體SMM培養(yǎng)基，研究CBM613菌株、CBM613/ΔhrcN突變株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回補菌株的運動性。通過測量菌落直徑，野生型菌株、突變株和回補菌株的運動能力沒有顯著差異，結(jié)果表明hrcN基因敲除沒有影響青枯雷爾氏菌的運動性（圖11）。
2.8 hrcN基因?qū)η嗫堇谞柺暇锉荒ば纬赡芰Φ挠绊?
通過對比菌株CBM613、CBM613/ΔhrcN突變株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回補菌株的生物被膜形成能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種青枯雷爾氏菌株的生物被膜形成能力隨培養(yǎng)時間增加而增強，突變株相比于野生型菌株，生物被膜形成能力顯著減弱，而回補菌株與野生型菌株相比差異不明顯（圖12）。
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