蝦醬是具有一定營養(yǎng)價(jià)值的傳統(tǒng)發(fā)酵食品之一，一般以毛蝦、蝦頭或者蝦肉為原料。這些原料在內(nèi)源酶及微生物共同作用下，經(jīng)過一段時(shí)間發(fā)酵，其中的蛋白質(zhì)和脂肪發(fā)生水解，轉(zhuǎn)化為多肽、氨基酸和有機(jī)酸等具有生物活性的物質(zhì)，同時(shí)也形成蝦醬特征風(fēng)味。蝦醬中微生物群落復(fù)雜，涉及到乳酸菌、芽孢桿菌等多種菌群參與。菌株在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的蛋白酶或脂肪酶等代謝物能促進(jìn)蝦組織的水解，進(jìn)而加速發(fā)酵過程；產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)則可在一定程度上防止腐敗發(fā)生，從而減少蝦醬中鹽分的添加。發(fā)酵溫度、時(shí)間、調(diào)味料的添加以及是否接種發(fā)酵劑都會(huì)對蝦醬微生物群落組成產(chǎn)生影響。
芽孢桿菌是革蘭氏陽性桿菌，依靠鞭毛運(yùn)動(dòng)，屬于好氧或兼性厭氧菌，能產(chǎn)生孢子。芽孢桿菌對外界環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)，能在比較不利的溫度和pH范圍下存活。芽孢桿菌及其分泌的多種代謝物具有抑菌、抗氧化等功效。部分芽孢桿菌因?yàn)榫哂挟a(chǎn)胞外蛋白酶、酯酶和甲殼素酶的能力，可以用作發(fā)酵劑發(fā)酵蝦醬。研究表明芽孢桿菌在蝦醬發(fā)酵的過程中對菌群和風(fēng)味的變化起到了非常重要的作用。也有研究表明從傳統(tǒng)發(fā)酵蝦醬中篩選出的枝芽孢菌ZV10-1和尼泊爾葡萄球菌JS11組合作為發(fā)酵菌株發(fā)酵蝦醬，采用頂空氣相色譜-離子遷移譜/質(zhì)譜（HS-GC-IMS/MS）方法鑒定出蝦醬中含有95種揮發(fā)性化合物，其指紋圖譜與傳統(tǒng)蝦醬相似，芳香和支鏈醛的含量卻有所增加，更有助于產(chǎn)生宜人香氣。植物乳桿菌和解淀粉芽孢桿菌混合發(fā)酵也可以縮短發(fā)酵周期，改善蝦醬顏色，并可增加其中的谷氨酸含量。但對芽孢桿菌作為發(fā)酵劑對蝦醬細(xì)菌菌群的影響較少，還有待進(jìn)一步研究。
基于目前的研究狀況，本研究以前期從自然蝦醬中分離的具抑菌和抗氧化功能、產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶并且具有溶血安全性的解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens Y11和貝萊斯芽孢桿菌B.velezensis Y12為發(fā)酵劑，參考目前低鹽蝦醬的鹽分含量，以10%（w/w）作為蝦醬制作食鹽添加量，研究單菌和混菌發(fā)酵對蝦醬品質(zhì)和微生物菌群變化的影響，為蝦醬發(fā)酵的方法開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。
蝦醬制作
選定前期從自然蝦醬中分離解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens Y11和貝萊斯芽孢桿菌B.velezensis Y12為發(fā)酵劑，將毛蝦清洗攪碎后接入發(fā)酵劑（1%，v/v），區(qū)別于傳統(tǒng)發(fā)酵中20%~30%高鹽添加量，參考目前已有制作低鹽蝦醬所采用的12%（w/w）的鹽分含量（其鹽分含量在8周發(fā)酵時(shí)間內(nèi)在10%~13%區(qū)間波動(dòng)），本研究所采用的鹽分添加量為10%（w/w），分別設(shè)置A、B、C、M四組。其中A組接入發(fā)酵劑解淀粉芽孢桿菌Y11；B組接入發(fā)酵劑貝萊斯芽孢桿菌Y12；C組為對照組（不接入菌株作為發(fā)酵劑）采取自然發(fā)酵方式；M組為同時(shí)接入發(fā)酵劑解淀粉芽孢桿菌Y11和貝萊斯芽孢桿菌Y12（1:1，v/v）進(jìn)行混菌發(fā)酵，于室溫（20℃左/>右）進(jìn)行。在F1（發(fā)酵的起始階段）、F2（發(fā)酵10 d）、F3（發(fā)酵80~90 d）、F4（發(fā)酵120~130 d）對四組樣品分別取樣（圖1）。
蝦醬菌群多樣性分析
按照發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)分別對蝦醬樣品DNA進(jìn)行取樣，使用Ezup柱基因組DNA純化試劑盒提取總基因組DNA。使用TransStart Fastpfu DNA聚合酶擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3~V4區(qū)。PCR產(chǎn)物使用sanpercolumn PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化。使用Illumina HiSeq平臺對16S rRNA基因進(jìn)行測序。探究發(fā)酵蝦醬細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)。
蝦醬微生物群落變化分析
采用擴(kuò)增子測序?qū)ξr醬的細(xì)菌微生物多樣性進(jìn)行分析（圖2），在屬水平前10種微生物主要有：Alkalibacterium（嗜鹽嗜堿菌）、Atopostipes（肉桿菌）、Psychrobacter（嗜冷桿菌）、Jeotgalibaca（咸海鮮芽孢桿菌）、Methylotenera（甲基營養(yǎng)型反硝化菌）、Ralstonia（羅爾斯通菌）、Staphylococcus（葡萄球菌）、Pseudomonas（假單胞菌）、Tetragenococcus（金黃色四聯(lián)球菌）、Salinicoccus（鹽水球菌）等為蝦醬發(fā)酵過程中的主要優(yōu)勢菌群。
圖2屬水平相對豐度Top10（a）和Top30（b）
注：橫坐標(biāo)大寫字母A、B、M、C分別對應(yīng)解淀粉芽孢桿菌Y11、貝萊斯芽孢桿菌Y11、兩種芽孢桿菌混合發(fā)酵和自然發(fā)酵，數(shù)字1~4分別對應(yīng)F1~F4四個(gè)不同發(fā)酵階段；Others表示圖中所列屬之外的其他所有屬的相對豐度之和。
研究結(jié)果表明，對于自然發(fā)酵蝦醬F1、F2階段采用本實(shí)驗(yàn)方法和相同取樣量沒有檢測到菌群的存在，可能由于其中菌群的豐度較低以及樣品DNA降解的原因；在F3發(fā)酵階段Alkalibacterium豐度最高，菌群多樣性較低，在F4階段，菌群多樣性增高，說明自然發(fā)酵蝦醬菌群豐度和多樣性的增加需要時(shí)間較長。A、B和M組在F1階段，可檢測到多個(gè)屬的菌群存在，但菌群相比百分比有所不同。單菌發(fā)酵A組、B組的Ralstonia、Psychrobacter、Methylotenera三種微生物占比較高，混菌發(fā)酵組M組Psychrobacter、Methylotenera兩種微生物相對豐度較高，Ralstonia微生物相對于A組、B組較低，但整體的微生物相對豐度分布的趨勢較為相近。在F2階段中，單菌發(fā)酵組A組、B組中Psychrobacter微生物相對豐度仍在增加，但Ralstonia在此階段有明顯的減少趨勢，Methylotenera也在相對減少，但在混菌發(fā)酵組M中，與A組、B組不同的是，Alkalibacterium在第二階段呈現(xiàn)出迅速增加的狀態(tài)。在發(fā)酵時(shí)間到達(dá)80~90 d時(shí)，A組、B組中Alkalibacterium、Staphylococcus逐漸占據(jù)優(yōu)勢地位。在F4階段，Alkalibacterium、Staphylococcus成為優(yōu)勢菌，混菌發(fā)酵組M組和自然發(fā)酵組C組與以上的菌群結(jié)構(gòu)相同。
蝦醬中細(xì)菌群落的構(gòu)成與地域和發(fā)酵工藝有關(guān)，同時(shí)也在很大程度上決定了蝦醬的品質(zhì)和風(fēng)味。研究發(fā)現(xiàn)泰國蝦醬中，在發(fā)酵初級階段，Salimicrobium spp.（53.6%））和Salinicoccus spp.（44.0%）豐度最高，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，菌群的多樣性和豐度也發(fā)生變化，Alkalibacterium，Macrococcus caseolyticus，Jeotgalicoccus psychophillus和Staphylococcus spp.等則逐漸占據(jù)優(yōu)勢?？梢苑置诎彪拿傅募?xì)菌的存在由于可通過水解提高與滋味形成有關(guān)的二肽和三肽的含量，因此對蝦醬滋味的形成非常重要。Alkalibacterium spp.，Jeotgalicoccus spp.，Lentibacillus spp.，Salimicrobium spp.，Salinicoccus spp.和Staphylococcus spp.等菌株的存在都與水產(chǎn)品風(fēng)味肽的形成有關(guān)，包括γ-Glu-Val-Gly和γ-Glu-Val等。另外Tetragenococcus以及Pseudomonas與非有機(jī)硫化物、氮氧化物以及長鏈烷烴的形成有關(guān)，Psychrobacter等與酯類等芳香化合物的形成有關(guān)。菌群組成與電子鼻初步分析結(jié)果較為一致，同時(shí)混菌發(fā)酵菌群在F1階段與自然發(fā)酵蝦醬菌群組成類似，也進(jìn)一步證實(shí)了混菌發(fā)酵可以縮短蝦醬制作時(shí)間，可以在較短時(shí)間內(nèi)獲得類似自然發(fā)酵蝦醬風(fēng)味。
結(jié)論
本研究以B.amyloliquefaciens Y11、B.velezensis Y12菌作為發(fā)酵劑，探究單菌和混菌發(fā)酵在四個(gè)不同時(shí)間段對發(fā)酵蝦醬樣品的理化指標(biāo)及菌群結(jié)構(gòu)變化的影響。結(jié)果表明加入混菌發(fā)酵M組、單菌發(fā)酵A組、B組發(fā)酵蝦醬樣品與自然對照組C組相比，其理化指標(biāo)如感官、顏色等，化學(xué)指標(biāo)如MDA值、TVB-N值以及菌群結(jié)構(gòu)變化等都存在一定的差別。其中對混菌發(fā)酵的樣品來說，在10~80 d品質(zhì)較好，120 d左右混菌發(fā)酵蝦醬樣品的品質(zhì)指標(biāo)變化較大，可能會(huì)具有一些潛在食用安全隱患。綜上分析，研究表明加入發(fā)酵劑可對發(fā)酵蝦醬的品質(zhì)及菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，但要控制接入發(fā)酵劑的含量及發(fā)酵時(shí)間的長短。本研究對芽孢桿菌菌株作為發(fā)酵劑在發(fā)酵蝦醬中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
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