2.6同源性分析
GenBank中公布的其他產(chǎn)氣莢膜梭菌參考株序列與該菌株序列構建的系統(tǒng)進化發(fā)育樹見圖5，該菌株與北京人源(GenBank登錄號：KP944154.1)、安多牦牛源(GenBank登錄號：MN960262.1)、美國豬源(GenBank登錄號：JQ607422.1)、華東兔源(GenBank登錄號：KX986316.1)產(chǎn)氣莢膜梭菌具有較近的親緣性；與中國野豬源(GenBank登錄號：KX094441.1)產(chǎn)氣莢膜梭菌具有較遠的親緣性。
圖5牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌16S rRNA遺傳進化樹分析
2.7 MIC測定MIC
測定結果見表4，牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌對頭孢噻肟、氨芐西林、四環(huán)素、青霉素表現(xiàn)為敏感，對紅霉素表現(xiàn)為中度敏感，對慶大霉素、復方新諾明、多黏菌素B表現(xiàn)不敏感。
表4牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌MIC測量結果
3討論
生化試驗是利用生物化學的方法測定微生物的代謝產(chǎn)物、代謝方式和條件進而鑒別細菌的試驗。本試驗中所用牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌qinghai-12的生化鑒定結果與張瑾瑜鑒定結果相同，均符合產(chǎn)氣莢膜梭菌生化特征。
生長曲線是指以微生物生長量為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標所繪制的曲線；常用的微生物生長量的測定方法有對微生物數(shù)量、重量及群體生理指標的測定。本試驗選用數(shù)量測定中的比濁法，該方法可連續(xù)測定以獲得即時數(shù)據(jù)。本試驗結果顯示，牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌qinghai-12在接種后的0～4 h內(nèi)處于遲緩期，4～8 h處于對數(shù)生長期，8～24 h為生長平衡的穩(wěn)定期，在測定期間內(nèi)未測量到衰亡期。該結果與單雪梅等和王開功等測量的生長曲線結果不同，其原因可能是試驗方案的不同和菌株宿主來源不同。另外，本試驗未能測得衰亡期可能是因為生長后期死菌對菌液渾濁度產(chǎn)生影響，為了更準確地測定活菌的數(shù)量，應配合平板菌落計數(shù)法來對衰亡期菌落數(shù)進行校正。
由于蛋白質組成中常有酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸，且該類氨基酸在280 nm的紫外光處有最大吸收峰，故可根據(jù)280 nm處的吸光度大小來測量蛋白的含量。另外培養(yǎng)液中還存在核酸等成分，其最大吸收峰在260 nm，故可通過經(jīng)驗公式ρ(mg/mL)=1.45×OD280 nm-0.74×OD260 nm計算蛋白濃度，排除核酸的影響。本試驗利用該方法測得牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌qinghai-12的最佳產(chǎn)毒時間是10 h，此時蛋白質含量達4.173 mg/mL，且隨著時間的推移蛋白質含量持續(xù)增長。該結果與單雪梅等測量的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌的最佳產(chǎn)毒時間為10 h基本一致,與王開功等研究的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌所產(chǎn)毒素的最佳時間8 h有所差異，可能同樣是與產(chǎn)氣莢膜梭菌的宿主和毒素型有關。
MIC是測量抗菌藥物的抗菌活性大小的指標之一，指在體外培養(yǎng)細菌18～24 h后能抑制培養(yǎng)基內(nèi)病原菌生長的最低藥物濃度，可以直觀地了解病原菌的耐藥性。本試驗對頭孢噻肟、氨芐西林、四環(huán)素、青霉素、紅霉素、慶大霉素、多黏菌素B、復方新諾明8種常見抗菌藥進行MIC測定，結果顯示：牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌qinghai-12對頭孢噻肟、氨芐西林、四環(huán)素、青霉素表現(xiàn)為敏感，對紅霉素表現(xiàn)為中度敏感，對慶大霉素、復方新諾明、多黏菌素B表現(xiàn)不敏感。依據(jù)牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌qinghai-12來源地為青海，分析該地區(qū)可能存在慶大霉素、復方新諾明和多黏菌素B的濫用情況，推薦該地區(qū)疑似該菌感染動物優(yōu)先選用頭孢噻肟、氨芐西林、四環(huán)素、青霉素類藥物，對紅霉素的使用需慎重，必要時交叉用藥，避免耐藥性的產(chǎn)生。
綜上所述，本試驗復蘇菌株為牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌，其生長特性符合梭菌生長規(guī)律，在梭菌增菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 h達到最佳產(chǎn)毒時間，且對慶大霉素、復方新諾明和多黏菌素B耐藥，對今后牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌后續(xù)研究及防治等方面具有一定的指導意義。