2.5數(shù)據(jù)分析


(1)當(dāng)哈維氏弧菌PBVH3311密度為103、104、105cfu/mL時(shí)(低密度弧菌)，擬合多元二次回歸方程，擬合結(jié)果為:f(x，y)=9.09-0.3339x+0.02325y+0.00267x2-0.0002273xy+0.0002477y2[f(x，y)為抑菌圈直徑(mm)，x為哈維氏弧菌PBVH3311密度(×103cfu/mL)，y為假交替單胞菌WCPW15003密度(×103cfu/mL)]。


當(dāng)哈維氏弧菌PBVH3311密度為103、104、105cfu/mL時(shí)，若要實(shí)現(xiàn)100%拮抗效果，即r2=1(方程實(shí)際r2=0.9866)，此時(shí)f(x，y)=5.98×(1+0.0134)=6.06。因此，當(dāng)哈維氏弧菌PBVH3311為103～105cfu/mL時(shí)，實(shí)現(xiàn)100%拮抗作用的方程應(yīng)為：6.06=9.09-0.3339x+0.02325y+0.00267x2-0.0002273xy+0.0002477y2。


(2)當(dāng)哈維氏弧菌PBVH3311密度為106、107、108cfu/mL時(shí)(高密度弧菌)，擬合多元二次回歸方程，擬合結(jié)果為：f(x，y)=8.395-0.1682x+0.1161y+0.00106x2-0.00000675xy-0.0001026y2[f(x，y)為抑菌圈直徑(mm)，x為哈維氏弧菌PBVH3311密度(×106cfu/mL)，y為假交替單胞菌WCPW15003密度(×106cfu/mL)]。


當(dāng)哈維氏弧菌PBVH3311密度為106、107和108cfu/mL時(shí)，若要實(shí)現(xiàn)100%拮抗效果，即r2=1(方程實(shí)際r2=0.9544)，此時(shí)f(x，y)=5.98×(1+0.0456)=6.25。因此，當(dāng)哈維氏弧菌PBVH3311為106～108cfu/mL時(shí)，實(shí)現(xiàn)100%拮抗作用的方程應(yīng)為：6.25=8.395-0.1682x+0.1161y+0.00106x2-0.00000675xy-0.0001026y2。


3討論


3.1拮抗菌WCPW15003及其培養(yǎng)基優(yōu)化


哈維氏弧菌是南海近岸海洋環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)菌種之一，也是華南地區(qū)海水養(yǎng)殖動(dòng)物最常見的細(xì)菌性病原，常引發(fā)對(duì)蝦發(fā)光病、對(duì)蝦早期偷死綜合征、石斑魚爛身病等多種嚴(yán)重疾病。


革蘭氏陽性菌被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，其中應(yīng)用較為普遍的主要是乳酸菌和一些芽孢桿菌等。Zokaeifar等報(bào)道，將兩株芽孢桿菌以108cfu/mL密度添加到飼料中，投喂8周齡凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)時(shí)，能夠促進(jìn)其生長(zhǎng)及提高消化酶活力，且對(duì)哈維氏弧菌有明顯抑菌活性。雖然革蘭氏陰性菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用相對(duì)較少，但有些假交替單胞菌屬菌種等也是公認(rèn)的益生菌。Fjellheim等報(bào)道，假交替單胞菌對(duì)大西洋鱈(Gadusmorhua)生長(zhǎng)環(huán)境中的鰻弧菌(V.anguillarum)具有拮抗作用；Kesarcodi-Watson等報(bào)道了假交替單胞菌可保護(hù)貝類幼苗免受燦爛弧菌(V.splendidus)的侵染；其他的研究結(jié)果也表明，假交替單胞菌對(duì)哈維氏弧菌、副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)等多種病原體有顯著拮抗作用。這與本研究結(jié)果基本一致，即假交替單胞菌WCPW15003對(duì)哈維氏弧菌PBVH3311具有明顯的拮抗作用。


在大多數(shù)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，只有當(dāng)弧菌密度超過104cfu/mL時(shí)，才易暴發(fā)養(yǎng)殖動(dòng)物弧菌??；同時(shí)，通過回歸方程可得知，假交替單胞菌WCPW15003密度應(yīng)大于或等于養(yǎng)殖水體中弧菌密度，才會(huì)表現(xiàn)出明顯的拮抗效果。因此，提高菌液中菌體密度是實(shí)現(xiàn)假交替單胞菌WCPW15003應(yīng)用的必要前提。盡管2216E是絕大多數(shù)海洋細(xì)菌的培養(yǎng)基，但由于營養(yǎng)成分含量相對(duì)單一，不適宜假交替單胞菌WCPW15003的高密度培養(yǎng)。筆者通過對(duì)2216E培養(yǎng)基的優(yōu)化，可使假交替單胞菌WCPW15003密度由2.31×108cfu/mL升至3.36×109cfu/mL，可基本滿足假交替單胞菌WCPW15003規(guī)模化培養(yǎng)和在小水體應(yīng)用的要求，為今后建立該拮抗菌的連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)和生產(chǎn)應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)。


3.2拮抗菌WCPW15003對(duì)哈維氏弧菌病原拮抗機(jī)制


在基于培養(yǎng)皿的拮抗試驗(yàn)中，當(dāng)病原菌哈維氏弧菌PBVH3311密度為103～105cfu/mL時(shí)，抑菌圈為清晰的全透明圈；當(dāng)病原菌哈維氏弧菌PBVH3311密度大于106cfu/mL時(shí)，抑菌圈為兩個(gè)同心圓，全透明圈在內(nèi)，半透明圈在外。據(jù)此推測(cè)，當(dāng)病原菌哈維氏弧菌PBVH3311密度較低時(shí)，拮抗菌假交替單胞菌WCPW15003通過識(shí)別弧菌并分泌胞外產(chǎn)物啟動(dòng)了第一套具有殺菌作用的拮抗機(jī)制，實(shí)現(xiàn)了低密度的拮抗菌假交替單胞菌WCPW15003的拮抗作用，擬合方程為：6.06=9.09-0.3339x+0.02325y+0.00267x2-0.0002273xy+0.0002477y2；當(dāng)病原菌哈維氏弧菌PBVH3311密度較高時(shí)，拮抗菌假交替單胞菌WCPW15003除啟動(dòng)上述第一套拮抗機(jī)制外，還同時(shí)啟動(dòng)了具有抑菌作用的第二套拮抗機(jī)制，且該機(jī)制分泌的胞外產(chǎn)物在瓊脂中的擴(kuò)散速度大于第一套拮抗機(jī)制分泌的胞外產(chǎn)物，因此，產(chǎn)生半透明抑菌圈大于全透明圈的現(xiàn)象，此時(shí)的擬合方程為：6.25=8.395-0.1682x+0.1161y+0.00106x2-0.00000675xy-0.0001026y2。這一結(jié)果為后續(xù)開展該拮抗菌作用機(jī)制的研究奠定了重要基礎(chǔ)。同時(shí)表明，該拮抗菌既可殺滅貧營養(yǎng)海水中的少量弧菌，又可抑制富營養(yǎng)海水中出現(xiàn)高密度的弧菌，還可保持富營養(yǎng)水體中剩余少量弧菌(承擔(dān)養(yǎng)殖水體的物質(zhì)循環(huán)作用)，從而有利于成功構(gòu)建基于細(xì)菌的“活水”的養(yǎng)殖系統(tǒng)。也就是說，該拮抗菌今后不僅可用于養(yǎng)殖前期的海水消毒，還可用于養(yǎng)殖水體中弧菌密度控制，防止因高密度弧菌引發(fā)海水養(yǎng)殖弧菌病的暴發(fā)，且不會(huì)導(dǎo)致水體因完全缺少細(xì)菌而成為“死水”。


總之，本研究不僅確定了假交替單胞菌WCP15003的生長(zhǎng)特性及其對(duì)哈維氏弧菌PBVH3311存在顯著的拮抗效果，還根據(jù)不同弧菌密度率先確定了該拮抗菌對(duì)弧菌的多元二次回歸方程，可根據(jù)養(yǎng)殖水體中弧菌密度，確定拮抗菌的準(zhǔn)確使用量，這為假交替單胞菌WCPW15003在生產(chǎn)中精準(zhǔn)施用技術(shù)開發(fā)夯實(shí)了理論基礎(chǔ)。


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