1.6 FITC標(biāo)記噬菌體檢測(cè)沙門菌的檢測(cè)參數(shù)確定
1.6.1 FITC標(biāo)記噬菌體
將3 mL噬菌體(1.0×1010 PFU/mL)與60μL FITC(10-5 mol/L)混合，加入2.5 mL反應(yīng)液(1×PBS∶DMSO=4∶1，pH=8.5)。由于FITC分子在酸性環(huán)境下會(huì)形成沉淀，因此要保持整個(gè)反應(yīng)體系的pH在8.0~8.5。避光冰浴過夜后透析，選擇截留分子為3 500 Da的透析袋，1×PBS避光透析，每隔12 h換一次透析液，透析48 h后取出并測(cè)定標(biāo)記后噬菌體滴度。最后將純化的FITC標(biāo)記噬菌體溶液于4℃避光保存。
1.6.2 FITC標(biāo)記的噬菌體吸附宿主的最佳孵育時(shí)間
取200μL FITC標(biāo)記的噬菌體(8.5×109 PFU/mL)與200μL雞白痢沙門菌C79-13(1.0×106 CFU/mL)分別加入1.5 mL離心管，共5個(gè)平行管，皆加入600μL滅菌LB液體，置于培養(yǎng)箱中37℃、200 r/min分別孵育5 min、10 min、15 min、20 min和25 min后取出，各管中皆加入500μL多聚甲醛，室溫靜置20 min后4℃、8 000×g離心10 min，棄去上清液，去除未與宿主菌結(jié)合的FITC-噬菌體。然后，用500μL PBS重懸沉淀，重復(fù)離心洗滌三次。在最后一次離心后，加入50μL PBS重懸。吸取重懸液5μL于載玻片上，在樣品上滴加一滴SlowFade Diamond抗猝滅封片劑后蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察，根據(jù)觀察結(jié)果判定FITC-噬菌體吸附宿主細(xì)胞的最適孵育時(shí)間。
1.6.3 FITC標(biāo)記噬菌體的宿主特異性檢測(cè)
復(fù)蘇部分非宿主菌，并在37℃、200 r/min搖床過夜孵育，調(diào)整菌液濃度1.0×106 CFU/mL，重復(fù)1.6.2中步驟制備樣品鏡檢，同時(shí)用PBS替代非宿主菌液作空白對(duì)照。
1.6.4 FITC標(biāo)記噬菌體的檢測(cè)限測(cè)定
以PBS作為空白對(duì)照，將濃度為1.0×106 CFU/mL的宿主菌菌液按10倍稀釋，獲得5個(gè)稀釋濃度樣本，分別為10 CFU/mL、102 CFU/mL、103 CFU/mL、104 CFU/mL、105 CFU/mL。用1.6.2步驟獲得的FITC標(biāo)記的噬菌體(濃度為9×109 PFU/mL)與上述各樣本置于培養(yǎng)箱中37℃、200 r/min孵育15 min，以隨機(jī)10個(gè)視野中出現(xiàn)1個(gè)及以上熒光噬菌體結(jié)合目標(biāo)細(xì)菌后形成的熒光棒狀物，判定為陽性檢出，同時(shí)取樣3組同濃度的宿主菌菌液重復(fù)檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證，將最低陽性檢出率大于95%的菌液濃度確定為FITC標(biāo)記噬菌體的檢測(cè)限。
2結(jié)果
2.1噬菌體分離、純化、鑒定結(jié)果
以雞白痢沙門菌C79-13為宿主菌，從污水中分離得到一株裂解性強(qiáng)、遺傳穩(wěn)定的噬菌體，并命名為PC79-13。該噬菌體在雙層瓊脂上侵染細(xì)菌可產(chǎn)生清晰透亮的空斑。由圖1可知:噬菌體PC79-13是頭部直徑約60 nm的正二十面體，長尾，屬于有尾噬菌體目長尾噬菌體科。
圖1噬菌體PC79-13的噬菌斑(A)及透射電鏡形態(tài)(B)
2.2噬菌體宿主譜
將實(shí)驗(yàn)室保存的三種血清的沙門菌12株及52株大腸桿菌，用雙層平板瓊脂法檢驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)分離到的噬菌體PC79-13是否裂解這些菌株，結(jié)果如表2所示。噬菌體PC79-13可裂解4株雞白痢沙門菌，但不裂解任何一株大腸桿菌、腸炎沙門菌或鼠傷寒沙門菌。因此，噬菌體PC79-13可以初步判定為特異侵染雞白痢沙門菌的噬菌體。
2.3噬菌體生物學(xué)特性相關(guān)結(jié)果
2.3.1最佳MOI
結(jié)果顯示在MOI為0.01時(shí)，噬菌體PC79-13的效價(jià)達(dá)到1.4×1010 PFU/mL，為各MOI中最高。因此，噬菌體PC79-13的最佳MOI為0.01(圖2)。
圖2噬菌體PC79-13的最佳MOI
2.3.2一步生長曲線
根據(jù)最佳MOI(0.01)進(jìn)行一步生長曲線測(cè)繪，結(jié)果顯示，噬菌體效價(jià)在30 min前升高緩慢，在第30 min后出現(xiàn)爆發(fā)式增長，直至80 min左右上升速度減慢并逐漸趨于平衡穩(wěn)定，最高效價(jià)達(dá)到3.9×1010 PFU/mL，平均裂解量為186 PFU/cell(圖3)。
圖3噬菌體PC79-13的一步生長曲線
2.3.3紫外線敏感性
噬菌體置于距紫外燈光源30 cm處，直接照射15 min，90%噬菌體仍然保持感染活性。繼續(xù)照射15 min后，仍然有60%噬菌體保持感染宿主菌活性。持續(xù)照射45 min，噬菌體效價(jià)大幅度降低，從1010降低至104(圖4)。
圖4噬菌體PC79-13的紫外線敏感性
2.3.4熱穩(wěn)定性
根據(jù)熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繪圖(圖5)可知:本株噬菌體對(duì)高溫的耐受性較強(qiáng)，在50℃水浴90 min時(shí)仍然能維持108 PFU/mL效價(jià)，在80℃水浴30 min時(shí)完全失去活性，在20~50℃范圍內(nèi)能維持效價(jià)穩(wěn)定在108 PFU/mL。
圖5噬菌體PC79-13熱穩(wěn)定性
2.3.5 pH穩(wěn)定性
由酸堿度對(duì)應(yīng)效價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖6)可知，噬菌體PC79-13在pH為3.0~11.0時(shí)效價(jià)較為穩(wěn)定，在pH為2.0時(shí)效價(jià)大幅度降低，在pH=13.0時(shí)徹底失去活性，在pH=7.0時(shí)效價(jià)最高，為5.0×108 PFU/mL。表明噬菌體PC79-13是一株對(duì)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿環(huán)境有較高抵抗力的菌株，其最適pH為7.0。
圖6噬菌體PC79-13的pH穩(wěn)定性
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