由于化石燃料消耗導(dǎo)致的氣候變化和環(huán)境惡化的挑戰(zhàn)，需要使用木質(zhì)纖維素生物質(zhì)作為原料高效生產(chǎn)第二代生物燃料。然而木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中存在的抑制劑會導(dǎo)致生長抑制和發(fā)酵效率受損。抑制劑主要包括乙酸、糠醛、5-羥甲基糠醛(5-HMF)等。酵母細(xì)胞絮凝是一種無性、可逆、鈣依賴性細(xì)胞聚集，廣泛用于經(jīng)濟(jì)有效地從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離生物質(zhì)。自絮凝酵母菌株SPSC01已用于工業(yè)連續(xù)乙醇發(fā)酵。絮凝賦予酵母細(xì)胞提高對乙醇和乙酸脅迫的耐受性。研究表明，操縱多個基因，如RTC1、ACS1、RCK1、PMA1、CCW12和ADY2，可以賦予酵母細(xì)胞更高的乙酸抗性。通過操縱蛋白激酶來提高酵母穩(wěn)健性的研究仍然有限。膜磷酸蛋白質(zhì)組分析已用于研究釀酒酵母對乙酸脅迫（在pH 4.0下暴露于50 mM乙酸1小時）的早期反應(yīng)，并確定調(diào)節(jié)各種轉(zhuǎn)運蛋白的蛋白激酶Hrk1參與乙酸脅迫酸應(yīng)激反應(yīng)。然而到目前為止，還沒有關(guān)于多組學(xué)數(shù)據(jù)的綜合分析來研究對乙酸脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)和培育強健酵母菌株的報道。膜磷酸蛋白質(zhì)組分析已用于研究釀酒酵母對乙酸脅迫（在pH 4.0下暴露于50 mM乙酸1小時）的早期反應(yīng)，并確定調(diào)節(jié)各種轉(zhuǎn)運蛋白的蛋白激酶Hrk1參與乙酸脅迫酸應(yīng)激反應(yīng)。然而到目前為止，還沒有關(guān)于多組學(xué)數(shù)據(jù)的綜合分析來研究對乙酸脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)和培育強健酵母菌株的報道。研究人員通過比較乙酸脅迫下的絮凝和非絮凝菌株，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組，以探索關(guān)鍵的應(yīng)激反應(yīng)蛋白。確定了幾種關(guān)鍵的蛋白激酶，可以通過操縱它們來提高酵母的應(yīng)激耐受性并增強纖維素乙醇的發(fā)酵。這項工作的結(jié)果為使用工業(yè)酵母高效生產(chǎn)纖維素乙醇提供了基礎(chǔ)。
Bioscreen全自動生長曲線分析儀的應(yīng)用
首先將菌株培養(yǎng)過夜并轉(zhuǎn)移至新鮮的YPD培養(yǎng)基中。當(dāng)種子生長到指數(shù)生長期時，通過3,000轉(zhuǎn)速離心3分鐘收集細(xì)胞，用無菌蒸餾水洗滌，并接種到微量滴定板中初始OD600為0.1的發(fā)酵培養(yǎng)基中。在Bioscreen C中，每0.5小時測量并記錄酵母菌株的細(xì)胞生長(OD600)。菌株的培養(yǎng)條件控制在30℃、中速振蕩。對于壓力耐受性測試，4 g/L糠醛或10 mM H2O2將添加到培養(yǎng)基中。工程酵母菌株的生長在搖瓶中通過Bioscreen C（Bioscreen，芬蘭）進(jìn)行評估。
實驗結(jié)果
多組學(xué)數(shù)據(jù)的綜合分析揭示了乙酸脅迫下酵母細(xì)胞絮凝導(dǎo)致多種蛋白激酶表達(dá)及其蛋白磷酸化狀態(tài)的變化。蛋白激酶Hog1和解毒酶基因GPX1的過度表達(dá)提高了應(yīng)激耐受性。隨后，與Hog1相互作用的關(guān)鍵蛋白激酶基因的過度表達(dá)增強了使用玉米芯水解物的乙酸耐受性和發(fā)酵性能。特別是通過過表達(dá)蛋白激酶基因AKL1，比生長率提高了40.0%，乙醇生產(chǎn)率提高了92.9%。這些結(jié)果提供了通過操縱關(guān)鍵蛋白激酶來提高纖維素乙醇產(chǎn)量的替代策略。
圖1、通過酵母細(xì)胞絮凝提高醋酸耐受性。A，絮凝菌株SPSC01和非絮凝菌株P(guān)LY01（SPSC01-ΔFLO1）的觀察。上圖，搖瓶培養(yǎng)物的照片；下圖：光學(xué)顯微鏡下的圖像。B，兩個菌株在5.0 g/L乙酸存在下的乙醇發(fā)酵。
圖2、提高的抗氧化能力賦予細(xì)胞對乙酸更高的抵抗力。A，乙醇發(fā)酵過程中在有或沒有5.0 g/L乙酸脅迫的情況下SPSC01和PLY01中ROS的積累。B，5.0 g/L乙酸脅迫下SPSC01和PLY01的GPX活性。C和D，PLY01和PLY01-GPX1在5.0g/L乙酸脅迫下的生長和乙醇發(fā)酵性能。
圖3、Hog1是對乙酸反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。A）通過比較SPSC01及其非絮凝突變體PLY01獲得的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)中的富集磷酸化殘基基序，通過MOMO檢測到。B和C，親本菌株P(guān)LY01、HOG1過表達(dá)菌株P(guān)LY01-HOG1和HOG1缺失菌株P(guān)LY01-ΔHOG1在5.0 g/L乙酸脅迫下的生長和發(fā)酵性能。在PLY01和PLY01-HOG1中測試了D和E、ROS積累和GPX活性。
圖4、多種蛋白激酶與Hog1相互作用并導(dǎo)致醋酸耐受性。A和B）在5.0 g/L乙酸存在下，使用過表達(dá)六種選定蛋白激酶基因的重組酵母菌株和對照菌株P(guān)LY01的細(xì)胞生長和乙醇發(fā)酵性能。C）通過酵母雙雜交系統(tǒng)驗證了Hog1在體內(nèi)與選定的蛋白激酶相互作用。PC，陽性對照。NC，陰性對照。AD、GAL4激活域。BD、GAL4 DNA結(jié)合域。AD和BD分別與Hog1或靶蛋白激酶融合。
圖5、關(guān)鍵蛋白激酶和抗氧化應(yīng)激相關(guān)基因的過度表達(dá)可改善纖維素乙醇發(fā)酵。A和B，基因過表達(dá)菌株在含有模擬玉米秸稈水解產(chǎn)物抑制劑混合物的發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長和乙醇發(fā)酵。C和D，使用玉米芯水解產(chǎn)物的PLY01、PLY01-HOG1和PLY01-AKL1的生長和乙醇發(fā)酵。
總結(jié)
細(xì)胞自絮凝賦予酵母菌株改善的環(huán)境脅迫耐受性，有利于生物生產(chǎn)。探索絮凝細(xì)胞和非絮凝細(xì)胞之間代謝和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的差異，有利于開發(fā)具有令人滿意的發(fā)酵效率的菌株。在這項工作中，研究人員使用絮凝酵母釀酒酵母對轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組進(jìn)行了綜合分析SPSC01及其非絮凝突變體在乙酸脅迫下生長，結(jié)果揭示了蛋白激酶的顯著變化。通過絮凝上調(diào)的絲裂原激活蛋白激酶Hog1的過度表達(dá)導(dǎo)致ROS積累減少和谷胱甘肽過氧化物酶活性增加，從而導(dǎo)致壓力下乙醇產(chǎn)量的提高。在測試的七個編碼蛋白激酶的基因中，AKL1在過表達(dá)時表現(xiàn)出最佳性能，在玉米芯水解產(chǎn)物和模擬玉米秸稈水解產(chǎn)物中實現(xiàn)了更高的乙醇生產(chǎn)率。這些結(jié)果為通過改造釀酒酵母中的關(guān)鍵蛋白激酶來提高纖維素乙醇的生產(chǎn)提供了替代策略。
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