母乳是嬰兒早期的食物和營(yíng)養(yǎng)來源，其含有乳糖和具有豐富營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的母乳低聚糖(Human milk oligosaccharides，HMO)。這些HMO包括2'-巖藻糖基乳糖(2'-Fucosyllactose，2'-FL；CAS:41263-94-9，分子量488.4g/mol)、3-巖藻糖基乳糖(3-Fucosyllactose，3-FL;CAS:41312-47-4，分子量488.4g/mol)、6'-唾液乳糖（6'-sialyllactose，6'-SL）和3'-唾液乳糖（3'-sialyllactose，3'-SL）等。含HMO的乳制品可為嬰幼兒提供此類活性物質(zhì)，促進(jìn)健康成長(zhǎng)。其中乳糖雖屬于能量物質(zhì)，但人體存在乳糖不耐受問題，因此含HMO的乳制品對(duì)乳糖含量有嚴(yán)格限制，例如2022年的12月1日正式生效的美國(guó)《食品化學(xué)法典》規(guī)定，2'-FL中乳糖含量不得高于8%。
HMO可采用提取法生產(chǎn)或采用動(dòng)物乳制品替代，但包括牛乳在內(nèi)的動(dòng)物乳制品，HMO含量較低，無法滿足營(yíng)養(yǎng)需求。而從動(dòng)物乳品中提取HMO的提取效率也較低。盡管有關(guān)于化學(xué)合成法制備HMO的報(bào)道，但HMO的化學(xué)合成仍然效率低下，其主要原因是HMO具有多個(gè)手性中心，為減少副產(chǎn)物，需要對(duì)多個(gè)羥基進(jìn)行保護(hù)，從而使合成復(fù)雜化。因此，發(fā)酵法是目前生產(chǎn)HMO的主要工業(yè)生產(chǎn)方法。
關(guān)于發(fā)酵法制備HMO的改進(jìn)是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。其中改進(jìn)方向主要有兩個(gè)，一個(gè)方向是針對(duì)菌株的改進(jìn)，即通過對(duì)菌株中涉及HMO合成和分泌相關(guān)的生物合成途徑進(jìn)行基因工程改造，提高HMO的合成和分泌；另一個(gè)方向是根據(jù)菌株的發(fā)酵生長(zhǎng)過程，對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。前者的相關(guān)研究較多，如CN202011240682.5、CN202110823715.7、CN202211067625.0提供了幾種工程大腸埃希氏菌提高了2'-FL、3-FL的產(chǎn)量。后者則主要根據(jù)發(fā)酵菌株不同生長(zhǎng)階段的目標(biāo)產(chǎn)物合成和分泌特點(diǎn)及其對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)條件的需求差異，人為延長(zhǎng)目標(biāo)產(chǎn)物合成和分泌的時(shí)間或量。例如，已知菌體生長(zhǎng)的主要階段包括延滯期(也稱為調(diào)整期、延遲期、遲緩期或適應(yīng)期)、指數(shù)期(也稱為對(duì)數(shù)期)、減速期(如分批發(fā)酵培養(yǎng)可能存在明顯的減速期)、穩(wěn)定期(也稱為平衡期、恒定期或最高生長(zhǎng)期)、衰亡期。其中菌株生長(zhǎng)曲線各階段對(duì)碳源、溫度、pH、溶氧的需求存在不同，目標(biāo)產(chǎn)物合成和分泌主要在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期至穩(wěn)定期，放罐收獲通常在衰亡期(農(nóng)業(yè)出版社1992年出版，山西省原平農(nóng)業(yè)學(xué)校主編《農(nóng)業(yè)微生物學(xué)》第114-117頁；中國(guó)醫(yī)藥科技出版社1999年出版，李榆梅主編《微生物學(xué)》第18-19頁；中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社2001年出版，徐鳳彩主編《酶工程》第57-58頁；武漢理工大學(xué)出版社2011出版年，劉明華、全永亮主編《食品發(fā)酵與釀造技術(shù)》第80-82頁)。因此，根據(jù)菌株在不同階段對(duì)培養(yǎng)條件的需求差異(中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社2001年出版，徐鳳彩主編《酶工程》第57-58頁；中國(guó)醫(yī)藥科技出版社2005年出版，余伯陽主編《中藥生物技術(shù)》第137-144頁)，通過動(dòng)態(tài)調(diào)控溫度、pH、溶氧或改變補(bǔ)料策略調(diào)控碳源濃度可在一定程度上提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。如，CN202110110430.9提供了一種分批補(bǔ)料的發(fā)酵策略，提高了2'-FL的產(chǎn)量。
然而，包括2'-FL和3-FL在內(nèi)的HMO目前發(fā)酵生產(chǎn)水平仍然較低，尤其是3-FL的產(chǎn)量受諸多因素限制，面臨瓶頸。
一種提高大腸埃希氏菌巖藻糖基乳糖產(chǎn)量的發(fā)酵生產(chǎn)方法，所述巖藻糖基乳糖為2'-巖藻糖基乳糖或3-巖藻糖基乳糖中的一種，所述發(fā)酵生產(chǎn)方法包括如下步驟：
大腸埃希氏菌選自大腸埃希氏菌K-12 MG1655、大腸埃希氏菌DE3、大腸埃希氏菌DSM33491中的一種。
S1繪制生長(zhǎng)曲線：取大腸埃希氏菌接種至種子搖瓶液培養(yǎng)后，取種子搖瓶液轉(zhuǎn)接入種子罐進(jìn)行種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)后取種子罐培養(yǎng)液接種至發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，監(jiān)測(cè)發(fā)酵罐中菌群生長(zhǎng)狀態(tài)、碳源濃度、乳糖濃度，繪制菌群生長(zhǎng)曲線，確定菌群生長(zhǎng)的衰亡期；
S2發(fā)酵生產(chǎn)：按照步驟S1的發(fā)酵培養(yǎng)條件，在發(fā)酵罐中生產(chǎn)巖藻糖基乳糖，培養(yǎng)至衰亡期時(shí)，取步驟S1所述種子罐培養(yǎng)液再次接種至發(fā)酵罐，補(bǔ)加乳糖，再次發(fā)酵培養(yǎng)。其中乳糖是大腸埃希氏菌轉(zhuǎn)化生成巖藻糖基乳糖的底物，而非碳源。因此，本領(lǐng)域公知，乳糖的補(bǔ)加可與再次接種同時(shí)進(jìn)行，也可于再次接種后，間隔一定時(shí)間再補(bǔ)加乳糖。
大腸埃希氏菌K-12 MG1655發(fā)酵生產(chǎn)3-巖藻糖基乳糖的菌群生長(zhǎng)曲線
大腸埃希氏菌K-12 MG1655發(fā)酵生產(chǎn)2'-巖藻糖基乳糖的菌群生長(zhǎng)曲線
通常認(rèn)為，發(fā)酵過程中，菌群生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期后，由于培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)失衡、底物限制、大量抑制性中間產(chǎn)物生成、pH和溶氧失衡等原因?qū)е戮核劳龃笥谏?。雖然此時(shí)發(fā)酵罐中仍存在碳源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和底物，但目標(biāo)產(chǎn)物合成趨于停滯，目標(biāo)產(chǎn)物積累的增長(zhǎng)幅度極小。因此發(fā)酵工藝中通常將菌群生長(zhǎng)的衰亡期作為放罐收獲期。目前通常在指數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期等階段，進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵、pH調(diào)控、溶氧調(diào)控等盡可能推遲衰亡期，延長(zhǎng)目標(biāo)產(chǎn)物合成所在的穩(wěn)定期等菌體生長(zhǎng)和目標(biāo)物分泌階段。
但在考察大腸埃希氏菌發(fā)酵生產(chǎn)2'-巖藻糖基乳糖或3-巖藻糖基乳糖的菌群生長(zhǎng)各階段特征時(shí)，出乎預(yù)料地發(fā)現(xiàn)：發(fā)酵培養(yǎng)至菌群生長(zhǎng)的衰退期后，雖然補(bǔ)加底物乳糖或補(bǔ)加培養(yǎng)基(即碳源)不能顯著提高2'-巖藻糖基乳糖或3-巖藻糖基乳糖產(chǎn)量，但當(dāng)補(bǔ)加一定量的菌種和底物乳糖后，仍可顯著提高產(chǎn)2'-巖藻糖基乳糖和3-巖藻糖基乳糖的產(chǎn)量。推測(cè)其原因可能是，此過程中對(duì)菌種的生物合成途徑中某種或某些相關(guān)酶造成了有利于促進(jìn)目標(biāo)物合成的突變或表達(dá)水平的轉(zhuǎn)變。
顯然，S2工藝中，衰亡期補(bǔ)加乳糖可以超量補(bǔ)加，也可僅按最低乳糖補(bǔ)加量進(jìn)行補(bǔ)加。當(dāng)不要求巖藻糖基乳糖產(chǎn)量達(dá)到同等條件最大值是(如同等再次接種接種量、同等發(fā)酵罐體積、同等發(fā)酵罐培養(yǎng)液體積、同等攪拌速度、同等溫度、同等pH、同等溶氧量條件下)，也可適當(dāng)降低乳糖補(bǔ)加量，即低于所述“最低乳糖補(bǔ)加量”。換言之，此處所述“最低乳糖補(bǔ)加量”為S1工藝同等條件下，衰亡期再次接種的接種量相同、衰亡期乳糖補(bǔ)加量不同時(shí)，達(dá)到S2工藝的巖藻糖基乳糖產(chǎn)量最大值所需的最低的乳糖補(bǔ)加量。顯然通過超量補(bǔ)加乳糖，可較快的獲得該條件下S2工藝的巖藻糖基乳糖產(chǎn)量最大值。
根據(jù)乳糖轉(zhuǎn)化率，采用如下常用公式，計(jì)算獲得最低乳糖補(bǔ)加量：
LS2min=(FS2max-FS1)/T-LS1res；其中LS2min為S2工藝的衰亡期最低乳糖補(bǔ)加量，單位為g；LS1res為S2工藝再次接種前發(fā)酵罐培養(yǎng)液中剩余的乳糖量，單位為g；FS1為S1工藝的巖藻糖基乳糖產(chǎn)量，單位為g；FS2max為S1工藝同等條件下，衰亡期再次接種的接種量相同、衰亡期乳糖補(bǔ)加量不同時(shí)，S2工藝的巖藻糖基乳糖產(chǎn)量最大值，單位為g；T為S1工藝的乳糖轉(zhuǎn)化率，T=巖藻糖基乳糖產(chǎn)量的g數(shù)/生成對(duì)應(yīng)g數(shù)巖藻糖基乳糖所消耗的乳糖g數(shù)。
通過在菌群生長(zhǎng)的衰亡期再次接種菌種和補(bǔ)加底物乳糖進(jìn)行常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)，無需再次進(jìn)行復(fù)雜的pH、溶氧等動(dòng)態(tài)調(diào)控即可顯著提高2'-巖藻糖基乳糖或3-巖藻糖基乳糖產(chǎn)量；為提高2'-巖藻糖基乳糖或3-巖藻糖基乳糖的工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)量提供了新的工藝和方法。
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