2結(jié)果與分析
2.1內(nèi)生放線(xiàn)菌的分離及轉(zhuǎn)化鬼臼毒素菌株的篩選
圖2鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜
圖3 CS-1轉(zhuǎn)化鬼臼毒素HPLC圖譜
利用純培養(yǎng)法從桃兒七根莖分離獲得20株內(nèi)生放線(xiàn)菌，編號(hào)為CS-1～CS-20。將20株內(nèi)生放線(xiàn)菌接種于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入鬼臼毒素繼續(xù)培養(yǎng)，然后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行TCL和HPLC分析，篩選能轉(zhuǎn)化鬼臼毒素的內(nèi)生放線(xiàn)菌。經(jīng)過(guò)幾輪篩選發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生放線(xiàn)菌CS-1能轉(zhuǎn)化鬼臼毒素生成產(chǎn)物1。圖2是鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜，圖3是CS-1菌株發(fā)酵液的HPLC圖譜，其中峰1是新出現(xiàn)的峰，為鬼臼毒素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的吸收峰，峰2是鬼臼毒素的吸收峰，峰3是培養(yǎng)基的吸收峰。HPLC檢測(cè)條件:色譜柱為C18(4.6 mm×250 mm，5μm)，流動(dòng)相乙腈∶水=40∶60，流速1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm。
2.2生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物1的結(jié)構(gòu)鑒定
生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物1(15 mg)為白色粉末。ESIMS中m/z 399處出現(xiàn)［M-H］－的分子離子峰，表明產(chǎn)物1的相對(duì)分子質(zhì)量為400，比底物鬼臼毒素小了14，恰好為1個(gè)亞甲基。其1H NMR(DMSO)數(shù)據(jù)與4'-去甲基表鬼臼毒素的文獻(xiàn)值一致(表1)，可以推斷它是4'-去甲基表鬼臼毒。
表1轉(zhuǎn)化產(chǎn)物11H NMR(DMSO)的化學(xué)位移(×10－6)
2.3鬼臼毒素轉(zhuǎn)化內(nèi)生放線(xiàn)菌鑒定
2.3.1形態(tài)特征菌株CS-1在ISP2培養(yǎng)基中產(chǎn)生基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，菌絲無(wú)橫隔，不斷裂(圖4)。菌落表面呈皺褶狀，顏色呈灰白色;基內(nèi)菌絲呈黃褐色，不產(chǎn)生可溶性色素。
圖4 CS-1在ISP2培養(yǎng)基上11 d的掃描電鏡照片
2.3.2培養(yǎng)特征菌株CS-1在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不長(zhǎng)，在蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較差，ISP3、LB、TSB、ISP4等培養(yǎng)基中生長(zhǎng)中等，在其他培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，在這9種培養(yǎng)基中都不產(chǎn)生可溶性色素，菌落形態(tài)、基內(nèi)菌絲顏色變化較大，見(jiàn)表2。
表2 CS-1在不同培養(yǎng)基上的特征
2.3.3生理生化特征
菌株CS-1在20～40℃、pH 6～12條件下可以生長(zhǎng)，能耐受10%NaCl，該菌能利用D-阿拉伯糖、D-果糖、D-甘露醇、肌醇、鼠李糖、甘油、膠醛糖、α-半乳糖、D-木糖，不能利用山梨醇、葡糖糖、山梨糖作為碳源;能較好地利用L-纈氨酸、L-谷氨酸、L-酪氨酸，微利用L-組氨酸，不利用L-色氨酸、L-賴(lài)氨酸、尿素、甘氨酸。菌株CS-1不能水解淀粉，可使明膠液化，牛奶凝固且凍化，能水解Tween 80、不能分解纖維素;不能使甲基紅變紅，不產(chǎn)生硫化氫，無(wú)法還原硝酸鹽，能產(chǎn)生色氨酸酶、氧化酶以及過(guò)氧化氫酶。生理生化特征見(jiàn)表3。2.3.416S rRNA的序列分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育N-J樹(shù)以菌株總DNA為模板，進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，回收、測(cè)序。測(cè)序結(jié)果(1 434 bp 16S rRNA基因)提交至NCBIGenBank，獲得登錄號(hào):JQ065718。將菌株16S rRNA基因序列與相近模式菌比對(duì)，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示，菌株與Streptomyces violaceorubidus LMG 20319T(AJ781374)最為接近，相似度為99.856%;兩者在進(jìn)化樹(shù)上呈單獨(dú)1枝，為鏈霉菌的疑似種，確定為Streptomyce sp.。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖5。
表3菌株CS-1的生理生化特征
圖5基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
3討論
用內(nèi)生放線(xiàn)菌CS-1對(duì)鬼臼毒素進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)它能將鬼臼毒素轉(zhuǎn)化為4'-去甲基表鬼臼毒素，表明內(nèi)生放線(xiàn)菌CS-1可能具有O-去甲基化酶，能在鬼臼毒素的甲氧酚上發(fā)生去甲基化反應(yīng)，還可能具有異構(gòu)化酶將C4位α構(gòu)型轉(zhuǎn)化為β構(gòu)型。并且這2種酶是同時(shí)或共同轉(zhuǎn)化鬼臼毒素，因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)4'-去甲基鬼臼毒素或表鬼臼毒素這樣的中間體。由此可以推測(cè)，內(nèi)生放線(xiàn)菌CS-1對(duì)鬼臼毒素的轉(zhuǎn)化路徑可能是由鬼臼毒素直接轉(zhuǎn)化為4'-去甲基表鬼臼毒素(圖6)。Hande研究發(fā)現(xiàn)4'-去甲基表鬼臼毒素抗腫瘤活性增強(qiáng)，其抗腫瘤機(jī)制發(fā)生改變，鬼臼毒素是通過(guò)破壞正在進(jìn)行有絲分裂細(xì)胞中的微管蛋白集結(jié)及微管的形成，使細(xì)胞有絲分裂停止在M期，抑制腫瘤細(xì)胞正常分裂，發(fā)揮抗腫瘤作用，而4'-去甲基表鬼臼毒素是通過(guò)抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的活性發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，可以通過(guò)進(jìn)一步改造4'-去甲基表鬼臼毒素獲得新的鬼臼類(lèi)化合物，為抗腫瘤藥物篩選提供更多先導(dǎo)化合物。內(nèi)生微生物(細(xì)菌、放線(xiàn)菌和真菌等)普遍存在于植物組織內(nèi)，與宿主建立了密切的互惠共生關(guān)系。在這種復(fù)雜的相互作用中，內(nèi)生微生物究竟扮演何種角色仍然不清楚。本研究也許能為這種相互作用的分子調(diào)控機(jī)制的理論探討，以及轉(zhuǎn)化天然產(chǎn)物的微生物的實(shí)驗(yàn)篩選提供一條新的途徑。
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